一種基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及一種基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法。
【背景技術】
[0002]百合是百合科百合屬的多年生草本球根植物，原產于中國，主要分布在亞洲東部、歐洲、北美洲等北半球溫帶地區(qū)，全球已發(fā)現(xiàn)有至少120個品種，其中55種產于中國。近年更有不少經過人工雜交而產生的新品種，如亞洲百合、香水百合、火百合等。鱗莖含豐富淀粉，可食，亦作藥用。百合鮮食干用均可。百合是中國傳統(tǒng)出口特產。
[0003]百合從古至今都是受人們喜愛的世界名花，百合花姿雅致，葉片青翠娟秀，莖干亭亭玉立，是名貴的切花新秀，在中國百合具有百年好合美好家庭、偉大的愛之含意，有深深祝福的意義。
[0004]百合現(xiàn)有的繁殖方法在生產上主要有鱗片繁殖、籽球繁殖和珠芽繁殖3種，具有繁殖效率慢，成球率較低或小鱗莖生根數(shù)量較少，繁殖系數(shù)低，且易受自然條件限制的缺點，隨著生物技術的發(fā)展，組織培養(yǎng)技術在一定程度上提高了繁殖效率，但仍具有操作復雜、成本投入大、污染率等缺點。不能滿足遺傳轉化過程中的大批量需求。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種轉化周期短、污染率低、成本低、操作簡便的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法。
[0006]—種基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，包括如下步驟:
[0007](A)在第一液體培養(yǎng)基中進行農桿菌培養(yǎng)；
[0008](B)進行菌液的離心，收集菌體，采用第二液體培養(yǎng)基重新懸浮菌體；
[0009](C)取洗凈的百合鱗片浸沒于重懸后的菌體中，取出百合鱗片，將其基部浸入所述第二液體培養(yǎng)基中，進行黑暗培養(yǎng)，即共培養(yǎng)；
[0010](D)取出共培養(yǎng)后的百合鱗片，置于噴霧式植物反應器中，進行百合鱗莖芽誘導，采用噴淋溶液對百合鱗莖進行噴淋處理，獲得誘導的小鱗莖；
[0011](E)將誘導的小鱗莖進行移栽，進行轉基因植株的篩選。
[0012]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中，步驟(A)中所述第一液體培養(yǎng)基為LB+Rifamycin 50mg/L+Km 50mg/L，體積為250mL，培養(yǎng)條件為:28°C,200rpm, 0D600 = 0.6-1.0 之間。
[0013]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中，步驟(B)中所述菌液在6000rpm條件下進行離心，收集菌體，用1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+As0.2mg/L重新懸浮菌體，至0D600 = 0.6-1.0之間。
[0014]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中，步驟(C)為共培養(yǎng)過程，具體包括如下步驟:
[0015]取洗凈的百合鱗片浸沒于重懸后的菌體中15分鐘，取出百合鱗片后將其置于培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器包括培養(yǎng)盤和與其匹配的盤蓋，所述培養(yǎng)盤由深色塑料制成，包括盤底和4個培養(yǎng)盤側壁，均為長方形，所述盤蓋由透明塑料制成，包括頂板和4個頂板側壁，均為長方形，所述培養(yǎng)盤和盤蓋的規(guī)格均為長18.5cm，寬14.5cm，高4.5cm ;4個所述培養(yǎng)盤側壁和4個所述頂板側壁均壓制成瓦楞型以增加強度；
[0016]在所述培養(yǎng)盤內的底部鋪設有培養(yǎng)基質，所述培養(yǎng)基質的鋪設高度為1.5cm，所述培養(yǎng)基質為陶粒或珍珠巖；在所述培養(yǎng)盤內底部還包括Icm高度的第二液體培養(yǎng)基，所述第二培養(yǎng)基為去除糖和銨鹽的1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+As0.2mg/L的溶液；
[0017]將所述百合鱗莖的基部向下插入固定在所述培養(yǎng)基質中，并使其基部浸沒在所述第二培養(yǎng)基內，蓋上所述盤蓋，于28 °C黑暗培養(yǎng)3-5天。
[0018]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中，步驟(D)具體包括如下步驟:
[0019]取出共培養(yǎng)后的百合鱗片，置于噴霧式植物反應器中，采用噴淋溶液噴淋處理，進行百合鱗莖芽誘導；
[0020]所述噴淋溶液為含有6-BA 5.0和NAA 1.0的溶液，設置噴霧控制系統(tǒng)，前15天每天噴霧6次，15天之后每天噴霧4次，每次2min，在每次噴淋結束后等待lmin，對噴霧式植物反應器底部的殘液進行過濾處理后回收，回收時間2min ;13-15天鱗片基部會萌發(fā)出不定芽，40-50天即可獲得誘導的小鱗莖。
[0021]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中，所述噴霧式植物反應器包括第一霧培箱、第二霧培箱、水箱、回收水箱和控制系統(tǒng):
[0022]所述第一霧培箱包括長方形的第一底板和頂部水平支架，所述頂部水平支架的左端通過兩個第一側支架分別與所述第一底板的左側兩端相連，所述頂部水平支架的右端通過兩個第一側支架分別與所述第一底板的右側兩端相連；所述第一霧培箱的內部包括第一培養(yǎng)架；所述第一底板為傾斜設置，與水平面的夾角為10?15°，在所述第一底板的較低一側設置有第一集水槽；在所述第一培養(yǎng)架的上部水平設置有第一導水管，在所述第一導水管的上部從左至右依次等距設置有6個第一霧化噴頭，在所述第一導水管的下部從左至右依次等距設置有7個第二霧化噴頭，6個所述第一霧化噴頭和7個所述第二霧化噴頭均與所述第一導水管相連通；
[0023]所述第二霧培箱包括均為長方形的第二底板和頂板，所述頂板的長與所述第二底板的長一致，寬小于所述第二底板的寬，所述頂板的4個端點分別通過第二側支架與所述第二底板的4個端點相連，所述第二霧培箱的內部包括第二培養(yǎng)架；所述第二底板為傾斜設置，與水平面的夾角為10?15°，在所述第二底板的較低一側設置有第二集水槽；在所述頂板下部前后水平設置有第二導水管和第三導水管；
[0024]所述第一培養(yǎng)架和所述第二培養(yǎng)架均由上下平行設置的多個置物網(wǎng)構成，所述多個置物網(wǎng)之間為可拆卸地連接，在每個所述置物網(wǎng)上間隔設置有多個置物海綿；
[0025]在所述第二培養(yǎng)架中，在最頂端的所述置物網(wǎng)的下部前后水平設置有第四導水管和第五導水管，在所述第二導水管、所述第三導水管、所述第四導水管、所述第五導水管上從左至右依次等距設置有7個第三霧化噴頭；
[0026]所述水箱通過第一管路與所述第一導水管相連，通過第二管路分別與所述第二導水管、所述第三導水管、所述第四導水管和所述第五導水管相連；
[0027]所述回收水箱的入口通過第三管路與所述第一集水槽的底部相連，通過第四管路與所述第二集水槽的底部相連，所述回收水箱的出口通過第五管路與所述水箱相連；
[0028]控制系統(tǒng)，在所述第一管路、所述第二管路、所述第三管路、所述第四管路、所述第五管路上均設置有閥門，在所述回收水箱的入口處、出口處以及所述水箱的出口處均設置有水栗和驅動裝置，所述控制系統(tǒng)與所述驅動裝置相連。
[0029]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中，6個所述第一霧化噴頭和7個所述第二霧化噴頭為從左至右交錯設置；在所述第一培養(yǎng)架和所述第二培養(yǎng)架中，相鄰的上下兩個所述置物網(wǎng)上的置物海綿為交錯設置；
[0030]在所述第一霧培箱和所述第二霧培箱的底部設置有多個支撐腳，在所述支撐腳的底部固定有萬向輪。
[0031]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中，所述第一霧培箱和所述第二霧培箱的四周均設置有透明塑料制成的板材，其中，前部的所述板材與所述第一霧培箱或第二霧培箱之間為活動連接；所述第二霧培箱的頂板為透明塑料制成的板材；
[0032]在所述第一霧培箱和所述第二霧培箱后側的板材外側固定有藍紫色光源，所述藍紫色光源為發(fā)出藍色光的LED燈帶，呈網(wǎng)狀布置。
[0033]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中在所述第三管路和所述第四管路上還設置有過濾裝置。
[0034]本發(fā)明所述的基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法，其中，所述第一培養(yǎng)架包括3個所述置物網(wǎng)，所述第二培養(yǎng)架包括4個所述置物網(wǎng)。
[0035]本發(fā)明基于噴霧式植物反應器的百合鱗片遺傳轉化方法相比傳統(tǒng)方法具有如下優(yōu)點:
[0036]I)農桿菌侵染、共培養(yǎng)都是在開放式環(huán)境下操作，不受環(huán)境條件限制，操作簡便；
[0037]2)無菌侵染工作量大，而且污染率高，侵染數(shù)量有限，而基于噴霧式植物反應器的百合遺傳轉化可實現(xiàn)大批量遺傳轉化，開放式培養(yǎng)不存在污染問題；
[0038]3)本發(fā)明所述基于噴霧式植物反應器遺傳轉化方法使營養(yǎng)液的養(yǎng)分得到高效利用，開放式培養(yǎng)，更好的促進幼苗