株SGC-7901/ TCF4以及轉(zhuǎn)入pCMV6-Entry載體質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞株SGC7901/C0N的轉(zhuǎn)移性。具體方法如下： 預(yù)先用marker筆在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板背后，沿直尺邊線均勻地劃橫線，每隔lcm-道，橫穿過 孔，然后在每個孔中加入5 X 105個細(xì)胞，使其過夜培養(yǎng)能鋪滿。第二天用200μ1的槍頭沿著 直尺邊線，垂直于孔背后的橫線劃痕，吸棄培養(yǎng)基，用roS洗3次，加入200ml培養(yǎng)基，放入37 °C5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按0、14小時的時間點取樣拍照，并統(tǒng)計細(xì)胞迀移覆蓋面積百 分比。
[0105] 結(jié)果如圖4所示，過表達TCF4的胃癌細(xì)胞株SGC-7901/TCF4比轉(zhuǎn)入pCMV6-Entry載 體質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞株SGC7901/C0N的轉(zhuǎn)移性明顯增強(P〈0.01)。
[0106] 結(jié)合本實施例與實施例3的結(jié)果，可見胃癌細(xì)胞株中TCF4蛋白的表達量越高，相應(yīng) 的其細(xì)胞迀移能力越強;TCF4蛋白的表達量越低，相應(yīng)的其細(xì)胞迀移能力越弱。
[0107] 實施例5、沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株迀移能力檢測 [0108] 一、沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株的制備
[0109] 1、TCF4沉默載體
[0110]用于沉默 TCF4的載體為 EdTP(addgene公司產(chǎn)品，Plasmid#24311，Gene/Insert name：EFlalpha-dnhTcf4//SV4〇-PuroR)〇
[0111] 2、沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株的制備及鑒定
[0112] (1)沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株的制備
[0113] 轉(zhuǎn)染前一天，以2X105/ml的細(xì)胞密度接種44AS3細(xì)胞到6孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)過夜， 臨用前配制240μ1無血清培養(yǎng)基OPT I-MEM (Life Technologies公司）與10μ1 lipofectamine 2000(Life Technologies公司）的混合液 1，以及2μ1 的EdTP載體(濃度為 1μ g/μL)與248μ1 0ΡΤΙ-ΜΕΜ的混合液2，靜置5min，將混合液1與2輕輕混勻，靜置20min;然后將 6孔板中的細(xì)胞用0ΡΤΙ-ΜΕΜ沖洗細(xì)胞二遍后，加入2ml 0ΡΤΙ-ΜΕΜ;將含質(zhì)粒的混合液逐滴加 入孔中，輕輕混勻，在37°C、5%的C02培養(yǎng)箱中保溫6h，更換含有血清的完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng) 箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，即可接種到新的培養(yǎng)板，培養(yǎng)液中含500μg/ml遺傳霉素(Geneticin， Life Technologies公司）進行篩選，待傳代時把細(xì)胞懸液稀釋至每個96孔板僅有一個細(xì) 胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，最后選出20個生長快速的單克隆細(xì)胞株。
[0114] (2)沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株的鑒定
[0115] 篩選出來的單克隆胃癌細(xì)胞株與親代細(xì)胞株生長至70%_80%滿度，經(jīng)預(yù)冷的roS 清洗后，加入RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司）與蛋白酶抑制劑(RoChe公司）混 合物冰上反應(yīng)30分鐘，離心提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒(Thermo Fisher Scientific 公司）測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸，采用SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)后的PVDF膜用5%BSA 緩沖液室溫封閉1小時后，加入抗β-Actin抗體工作液（1: 1000稀釋，8H10D10，Cell Signaling Technology公司）或抗TCF4抗體工作液（1:500稀釋，abl85736，Abeam公司）4°C 過夜。次日充分洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔八鼠二抗工作液(1:1000稀釋，Cell Signaling Technology公司），室溫孵育1小時，充分洗膜后浸入化學(xué)顯影液（Thermo Fisher Scientific公司），使用化學(xué)發(fā)光成像儀成像。采用Chemi Analysis分析軟件對蛋白電泳條 帶灰度值進行定量分析，蛋白表達量按照下列公式計算:蛋白量=目的蛋白灰度值/同一標(biāo) 本β-actin灰度值，分析結(jié)果后選擇TCF4表達量低且生長較為快速的單克隆胃癌細(xì)胞株作 為沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株，命名為44As3/dnTCF4。
[0116] 同時設(shè)置以pLenti hEFla-MCS//SV4〇-PuroR(在"Fuerer C，Nusse R.Lentiviral Vectors to Probe and Manipulate the ffnt Signaling Pathway.PLoS ONE 2010,5(2): e9370. doi : 10.1371/journal .pone.0009370"一文中有記載)對照質(zhì)粒替代EdTP載體轉(zhuǎn)染 44As3細(xì)胞的對照，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞命名為44As3/C0N。
[0117] 二、檢測沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株的迀移能力
[0118] 采用劃痕實驗方法檢測并比較步驟一構(gòu)建的沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株44As3/ dnTCF4以及轉(zhuǎn)入pLenti hEFla-MCS//SV40-PuroR對照質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞株44As3/C0N的轉(zhuǎn)移 性。具體方法參見實施例4步驟二。
[0119] 結(jié)果如圖5所示，沉默TCF4的胃癌細(xì)胞株44As3/dnTCF4比轉(zhuǎn)入pLenti hEFla-MCS//SV40-PuroR對照質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞株44As3/C0N的轉(zhuǎn)移性明顯減弱(P〈0.01)。
[0120]結(jié)合本實施例與實施例3、4的結(jié)果，進一步證實胃癌細(xì)胞株中TCF4蛋白的表達量 越高，相應(yīng)的其細(xì)胞迀移能力越強;TCF4蛋白的表達量越低，相應(yīng)的其細(xì)胞迀移能力越弱。
【主權(quán)項】
1. 用于檢測如下（1)-(3)中任一的檢測物在制備用于監(jiān)測胃癌發(fā)生和/或發(fā)展的產(chǎn)品 中的應(yīng)用： (1)TCF4蛋白； (2) 編碼所述TCF4蛋白的mRNA; (3) 編碼所述TCF4蛋白的基因。2. 用于監(jiān)測胃癌發(fā)生的系統(tǒng)，包含用于檢測如下（1)-(3)中任一的檢測物： (1)TCF4蛋白； (2) 編碼所述TCF4蛋白的mRNA; (3) 編碼所述TCF4蛋白的基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，其特征在于:所述系統(tǒng)還包含數(shù)據(jù)處理裝置;所述數(shù)據(jù) 處理裝置內(nèi)設(shè)模塊1和模塊2;所述模塊1具有如下（al)所示的功能，所述模塊2具有如下 (a2)所示的功能：（al)采集并比較待測者與對照者的組織樣本中所述TCF4蛋白或所述mRNA 或所述基因的表達量；（a2)根據(jù)比較結(jié)果按照如下方法確定所述待測者是否為胃癌患者： 若所述待測者的組織樣本中所述TCF4蛋白或所述mRNA或所述基因的表達量顯著高于所述 對照者的組織樣本中所述TCF4蛋白或所述mRNA或所述基因的表達量，則所述待測者為或候 選為胃癌患者;反之，則所述待測者不為或候選不為胃癌患者;所述對照者為健康人或良性 胃炎患者。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的系統(tǒng)，其特征在于:所述檢測物選自如下中任一種:抗所述 TCF4蛋白的特異性抗體、用于擴增所述基因的特異性擴增引物、用于檢測所述mRNA或所述 基因的探針或芯片。5. 如下(a)-(d)所示物質(zhì)中的任一種在促進胃癌細(xì)胞迀移和/或制備用于促進胃癌細(xì) 胞迀移的產(chǎn)品中的應(yīng)用： (a)TCF4 蛋白； (b) 所述TCF4蛋白的編碼基因； (c) 含有所述編碼基因的表達盒、重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞； (d) 能夠促進所述TCF4蛋白表達的物質(zhì)。6. 能夠抑制所述TCF4蛋白表達的物質(zhì)在抑制胃癌細(xì)胞迀移和/或制備用于抑制胃癌細(xì) 胞迀移的產(chǎn)品中的應(yīng)用。7. 用于促進胃癌細(xì)胞迀移的產(chǎn)品，其活性成分為如下(a)-(d)所示物質(zhì)中的任一種： (a)TCF4 蛋白； (b) 編碼所述TCF4蛋白的基因； (c) 含有所述編碼基因的表達盒、重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞； (d) 能夠促進所述TCF4蛋白表達的物質(zhì)。8. 用于抑制胃癌細(xì)胞迀移的產(chǎn)品，其活性成分為能夠抑制所述TCF4蛋白表達的物質(zhì)。9. 方法，為如下(A)或(B): (A) 促進胃癌細(xì)胞迀移的方法，包括如下步驟：向目的胃癌細(xì)胞中導(dǎo)入編碼TCF4蛋白的 基因，得到表達所述基因的重組胃癌細(xì)胞;所述重組胃癌細(xì)胞的迀移速度與所述目的胃癌 細(xì)胞的迀移速度相比提高； (B) 抑制胃癌細(xì)胞迀移的方法，包括如下步驟:抑制目的胃癌細(xì)胞中編碼TCF4蛋白的基 因的表達，得到所述基因被抑制的重組胃癌細(xì)胞;所述重組胃癌細(xì)胞的迀移速度與所述目 的胃癌細(xì)胞的迀移速度相比降低。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的應(yīng)用或系統(tǒng)或產(chǎn)品或方法，其特征在于:所述TCF4 蛋白為序列表中序列1所;^蛋白質(zhì)D
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種TCF4蛋白在作為胃癌檢測標(biāo)記物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為用于檢測如下(1)-(3)中任一的檢測物在制備用于監(jiān)測胃癌發(fā)生和/或發(fā)展的產(chǎn)品中的應(yīng)用：(1)TCF4蛋白；(2)編碼所述TCF4蛋白的mRNA；(3)編碼所述TCF4蛋白的基因。TCF4基因由于在正常組織、良性胃炎組織和胃癌組織中存在顯著表達差異，胃癌組織中TCF4基因表達遠(yuǎn)高于正常組織和良性胃炎組織；而且在低轉(zhuǎn)移性胃癌與高轉(zhuǎn)移性胃癌樣本中也存在顯著表達差異，高轉(zhuǎn)移性胃癌原發(fā)灶TCF4基因的表達高于低轉(zhuǎn)移性胃癌樣本，因此TCF4可以作為基因標(biāo)志物用于檢測胃癌的發(fā)生和發(fā)展，從而預(yù)測胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移并制定治療決策。
【IPC分類】C12Q1/68, G01N33/574, G01N33/68
【公開號】CN105483265
【申請?zhí)枴緾N201610021246
【發(fā)明人】沈國棟, 胡世蓮, 沈干, 程民, 徐婷娟, 徐佳慧
【申請人】安徽省立醫(yī)院
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月11日