分離基質(zhì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及可用于分離生物分子的分離基質(zhì)，制備分離基質(zhì)的方法和用分離基質(zhì) 分離生物分子的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 有許多情況需要從液體或從其它固體材料分離一種化合物，比如雜質(zhì)或期望的分 子。在很多領(lǐng)域使用基于電荷-電荷的相互作用來捕獲從而分離帶電或可帶電的化合物。
[0004] 在化學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，通常需要將祀化合物比如藥物或候選藥從制備過程產(chǎn)生 的污染物種(specy)分離。例如，由重組體宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)藥物或代藥將需要從 例如宿主細(xì)胞和可能的細(xì)胞碎片、其它宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、RNA和來自發(fā)酵肉湯的殘留物 比如鹽分離。由于其對祀化合物的通用性和敏感性，層析在許多目前使用的生物技術(shù)純化 方案中作為至少一個步驟設(shè)及。術(shù)語層析包括一系列密切相關(guān)的分離方法，它們?nèi)炕?使兩個互不混溶的相接觸的原理。更具體來講，將祀化合物引入流動相內(nèi)，使其與靜止相接 觸。當(dāng)祀化合物由流動相攜帶通過系統(tǒng)時，它將在靜止與流動相之間經(jīng)歷一系列相互作用。 該相互作用利用樣品組分的物理或化學(xué)性質(zhì)差異。
[000引層析的靜止相由基礎(chǔ)基質(zhì)組成，其上已偶聯(lián)配體，所述配體是能夠與祀化合物相 互作用的官能團(tuán)。因此，配體將賦予載體進(jìn)行分離、鑒定和/或純化感興趣的分子的能力。液 體層析法通常按用于分離化合物的相互作用原理命名。例如，離子交換層析基于電荷-電荷 相互作用;疏水相互作用層析化IC)利用疏水相互作用；和親和層析基于特異性生物學(xué)親和 力。還可同時使用多于一種相互作用原理，比如多元層析，其中最常使用具有離子交換官能 度連同又一種官能度(如疏水)的配體。
[0006] 眾所周知，離子交換基于帶電祀化合物與帶相反電荷的層析基質(zhì)之間的可逆相互 作用。洗脫最常通過增加鹽濃度進(jìn)行，但改變抑同樣是可能的。離子交換劑分為陽離子交換 劑，其中用帶負(fù)電荷的層析基質(zhì)吸附帶正電荷的祀化合物;和陰離子交換劑，其中用帶正電 荷的層析基質(zhì)吸附帶負(fù)電荷的祀化合物。術(shù)語"強(qiáng)"離子交換劑用于在寬抑區(qū)間帶電荷的離 子交換劑，而"弱"離子交換劑在某些抑值可帶電。一種常用的強(qiáng)陽離子交換劑包含橫酸基 配體，稱為S基團(tuán)。有時，此類陽離子交換劑通過官能團(tuán)及其與載體的連接劑所形成的基團(tuán) 而命名;例如SP陽離子交換劑，其中S基團(tuán)通過丙基(P)與載體連接。
[0007] 基礎(chǔ)基質(zhì)的性質(zhì)還將影響層析基質(zhì)的分離性質(zhì)。親水基礎(chǔ)基質(zhì)(如多糖)具有非常 低的固有蛋白吸附，而在大多數(shù)分離技術(shù)中疏水基礎(chǔ)基質(zhì)比如苯乙締或甲基丙締酸醋聚合 物需要親水表面改性W防止蛋白吸附。表面改性是復(fù)雜的因素，可有助于制造時批次之間 的變化?；A(chǔ)基質(zhì)的另一考慮是便于其官能化。根據(jù)用于偶聯(lián)配體的化學(xué)，可將基礎(chǔ)基質(zhì)活 化，即轉(zhuǎn)化為更有反應(yīng)性的形式。此類活化方法在本領(lǐng)域眾所周知，比如使親水基礎(chǔ)基質(zhì)比 如多糖的徑基燒化。共價配體附著通常通過使用基礎(chǔ)基質(zhì)上的反應(yīng)性官能度比如徑基、簇 基、琉基、氨基等實(shí)現(xiàn)。配體通常經(jīng)過簡稱為連接劑的連接臂附著于基礎(chǔ)基質(zhì)。該連接劑可 W是所用偶聯(lián)化學(xué)的結(jié)果或者故意引入W改善配體立體可及性的結(jié)構(gòu)。在任一情況下連接 劑的長度通常小于約10個原子。
[0008] 也已知將增長劑滲入分離基質(zhì)，特別是離子交換基質(zhì)中。增長劑是附著于基礎(chǔ)基 質(zhì)的聚合物種，在聚合物鏈上具有離子交換配體，均勻或無規(guī)地散布在鏈上或特定位置。已 發(fā)現(xiàn)使用增長劑增加對蛋白及其它生物分子的動態(tài)結(jié)合容量，運(yùn)可能是由于設(shè)及固體擴(kuò)散 現(xiàn)象。
[0009] W02007027139(GE Healthcare)描述分離基質(zhì)，其通過使葡聚糖增長劑與瓊脂糖 基礎(chǔ)基質(zhì)偶聯(lián)，然后使基質(zhì)與乙締基橫酸鋼反應(yīng)W將橫酸鹽陽離子交換配體偶聯(lián)在增長劑 上而制備。運(yùn)種構(gòu)造具有高剛性并顯示高動態(tài)蛋白容量。但是在某些應(yīng)用，比如分離單克隆 抗體，需要特定生物分子的更特異性的結(jié)合，W在離子交換步驟后實(shí)現(xiàn)更高的純度。
[0010] W02008145270(Merck Patent)描述分離基質(zhì)，其通過使帶電和疏水單體混合物與 聚甲基丙締酸醋基礎(chǔ)基質(zhì)接枝聚合而制備。運(yùn)種構(gòu)造產(chǎn)生在增長劑上具有帶電基團(tuán)和疏水 基團(tuán)兩者的增長劑，其改善對單克隆抗體的特異性，但不產(chǎn)生高動態(tài)容量。期望高動態(tài)容 量，因?yàn)樗峁└哌^程生產(chǎn)量。因此，需要產(chǎn)生高純度和高生產(chǎn)量W及適合重現(xiàn)性制造的新 基質(zhì)。
[0011] 發(fā)明簡述
[0012] 本發(fā)明一方面提供能夠W高生產(chǎn)量過程提供高純度的新分離基質(zhì)。運(yùn)用包含基礎(chǔ) 基質(zhì)的分離基質(zhì)實(shí)現(xiàn)，所述分離基質(zhì)具有包含與所述基礎(chǔ)基質(zhì)共價結(jié)合的疏水官能的第一 配體，并具有與所述基礎(chǔ)基質(zhì)共價結(jié)合的增長劑，所述增長劑包含第二離子交換配體。
[0013] 本發(fā)明特殊方面是制造能夠W高生產(chǎn)量過程提供高純度的新分離基質(zhì)的方法。運(yùn) 通過包含W下的方法實(shí)現(xiàn):a)使包含疏水官能的配體與基礎(chǔ)基質(zhì)偶聯(lián)和b)使包含離子交換 配體的增長劑與所述基礎(chǔ)基質(zhì)偶聯(lián)。運(yùn)些操作可按任何順序?qū)嵤?br>[0014] 本發(fā)明又一方面是制造能夠W高生產(chǎn)量過程提供高純度的新分離基質(zhì)的備選方 法。運(yùn)通過包含W下(任何順序)的方法實(shí)現(xiàn):a)使包含疏水官能的配體與基礎(chǔ)基質(zhì)偶聯(lián)，b) 使增長劑與所述基礎(chǔ)基質(zhì)偶聯(lián)和C)使離子交換配體與所述增長劑偶聯(lián)。
[0015] 本發(fā)明又一方面是制造能夠W高生產(chǎn)量過程提供高純度的新分離基質(zhì)的另一種 備選方法。運(yùn)通過包含W下(任何順序）的方法實(shí)現(xiàn):a)使包含疏水官能的配體與基礎(chǔ)基質(zhì) 偶聯(lián)和b)使包含帶電單體的單體與所述基礎(chǔ)基質(zhì)接枝聚合。
[0016] 本發(fā)明特殊方面是W高生產(chǎn)量從液體制劑分離至少一種祀生物分子至高純度的 方法。運(yùn)通過包括使所述液體制劑與分離基質(zhì)接觸的步驟的方法實(shí)現(xiàn)，所述分離基質(zhì)包含 含有與基礎(chǔ)基質(zhì)共價結(jié)合的疏水官能的第一配體和包含第二離子交換配體的增長劑。
[0017] 通過所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)W上一個或多個方面。從W下詳細(xì)描述和 權(quán)利要求將出現(xiàn)本發(fā)明另外的方面、細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)。
[001引附圖簡述
[0019] 圖1顯示用本發(fā)明分離基質(zhì)處理后，正下基配體含量怎樣影響對抗體進(jìn)料的動態(tài) IgG容量和殘留宿主細(xì)胞蛋白水平。
[0020] 圖2顯示用本發(fā)明分離基質(zhì)處理后，正下基配體含量怎樣影響抗體進(jìn)料中殘留的 慶大霉素水平。
[0021 ] 定義
[0022]術(shù)語"祀化合物"在本文指希望從水溶液分離的任何化合物、分子或其它實(shí)體。祀 化合物可W是期望的產(chǎn)物，或者液體產(chǎn)物不期望的雜質(zhì)。如果祀化合物是生物分子，可將其 稱為祀生物分子。
[0023] 術(shù)語"雜質(zhì)"在本文指存在于液體或固體材料中的任何不期望的化合物、分子或其 它實(shí)體。
[0024] 術(shù)語"多徑基聚合物"在本文指包含許多徑基的任何聚合物。
[002引術(shù)語"多糖"用于本文包括天然多糖、合成多糖、多糖衍生物、改性多糖及其任何混 合物。
[0026] 術(shù)語"配體"W其在層析中的常規(guī)含義用于本文，指包含能夠與祀化合物相互作用 的官能團(tuán)的實(shí)體。配體基團(tuán)的實(shí)例是帶正電或可帶正電的基團(tuán)（陰離子交換配體）；帶負(fù)電 或可帶負(fù)電的基團(tuán)（陽離子交換配體）；疏水基團(tuán)；對祀化合物具有特異性生物學(xué)親和力（比 如抗原對抗體的親和力）的基團(tuán)（親和力配體）；等。
[0027] 術(shù)語"增長劑"在本文指在至少一點(diǎn)共價附著于基礎(chǔ)基質(zhì)的聚合物。離子交換配體 與增長劑共價結(jié)合或者形成增長劑聚合物的整體部分。增長劑也稱為例如"柔性臂"、"觸 須"和有時"絨毛"。在上下文中，增長劑區(qū)別于連接劑之處在于增長劑是聚合物種，連接劑 不是。
[0028] 術(shù)語"基礎(chǔ)基質(zhì)"在本文指適合用于分離方法比如層析、分批吸附或膜分離的任何 固體材料，也稱為支持物或載體