上的反應(yīng)性基團之間的反應(yīng)。帶電試劑的實例是亞硫酸根離子、乙締基橫酸、胺（如=甲 胺）、縮水甘油基=甲基氯化錠、二乙基氨基乙基氯、氯乙酸、漠乙酸等，而增長劑上的反應(yīng) 性基團的實例是環(huán)氧化物、面代醇、雙鍵、徑基、胺等。
[0049] 在一個實施方案中制造方法包含a")使包含疏水官能的配體與基礎(chǔ)基質(zhì)偶聯(lián)和 b")使包含帶電單體的單體與所述基礎(chǔ)基質(zhì)接枝聚合。所述步驟可按任何順序?qū)嵤?，但在?個實施方案中步驟a")在步驟b")前實施W避免在增長劑上具有任何疏水配體。步驟a")可 按照上文a)或曰'）實施。接枝聚合是公知技術(shù)且已知幾種不同技術(shù)。在"由…接枝(grafting 打om)"技術(shù)中，用例如姉（IV)鹽、Fe27出〇2、銅（I)鹽、UV-照射的二苯甲酬、電離福射等在基 礎(chǔ)基質(zhì)上產(chǎn)生引發(fā)位點。然后使單體與引發(fā)位點反應(yīng)并擴散W便形成與基礎(chǔ)基質(zhì)共價結(jié)合 的聚合物鏈。在"通過…接枝(grafting t虹OU曲r技術(shù)中，使可共聚的基團比如乙締基、締 丙基、丙締基或甲基丙締基與基礎(chǔ)基質(zhì)偶聯(lián)。然后使基質(zhì)與單體接觸，引發(fā)聚合，W便單體 與偶聯(lián)的可聚合基團共聚。
[0050] 在一個實施方案中通過使基礎(chǔ)基質(zhì)與烷基或烷基芳基縮水甘油酸反應(yīng)使包含疏 水官能的配體與基礎(chǔ)基質(zhì)偶聯(lián)。烷基縮水甘油酸的實例是乙基縮水甘油酸、正丙基縮水甘 油酸、異丙基縮水甘油酸、正下基縮水甘油酸、異下基縮水甘油酸、叔下基縮水甘油酸、戊基 縮水甘油酸(所有異構(gòu)體）、己基縮水甘油酸(所有異構(gòu)體）、環(huán)己基縮水甘油酸、庚基縮水甘 油酸(所有異構(gòu)體）、辛基縮水甘油酸(所有異構(gòu)體）、癸基縮水甘油酸等。烷基芳基縮水甘油 酸的實例是苯基縮水甘油酸、芐基縮水甘油酸等。
[0051] 本發(fā)明一方面設(shè)及從液體制劑分離至少一種祀生物分子的方法，其包括使所述液 體制劑與分離基質(zhì)接觸的步驟，所述分離基質(zhì)包含含有與基礎(chǔ)基質(zhì)共價結(jié)合的疏水官能的 第一配體和包含第二離子交換配體的增長劑。在一個實施方案中基礎(chǔ)基質(zhì)包含瓊脂糖，在 另一個實施方案中增長劑包含葡聚糖。在又一個實施方案中離子交換配體包含陽離子交換 配體。
[0052] 在一個實施方案中祀生物分子是蛋白質(zhì)比如抗體?？贵w是工業(yè)上重要的蛋白質(zhì)， 本發(fā)明的基質(zhì)對抗體顯示高得驚人的選擇性和容量。
[0053] 在一個實施方案中祀生物分子與分離基質(zhì)結(jié)合，同時從基質(zhì)洗去或解吸未結(jié)合/ 較小強結(jié)合的雜質(zhì)，然后使基質(zhì)與解吸液體接觸W解吸祀生物分子。當(dāng)在柱中實施時，該方 式也稱為結(jié)合-洗脫層析，它通過選擇不同緩沖液(結(jié)合緩沖液、洗涂緩沖液和解吸緩沖液） 和任選使用緩沖液梯度用于解吸，提供充足的可能性使分離步驟的選擇性最佳。在備選實 施方案中祀生物分子和雜質(zhì)兩者與分離基質(zhì)結(jié)合，接著使分離基質(zhì)與選擇性解吸祀生物分 子的解析液體接觸。然后可將基質(zhì)上的殘余雜質(zhì)用再生液體解吸，然后再次使用分離基質(zhì)。 堿性溶液比如0.1M-2M NaOH可用作再生液體，但也可使用其它液體。
[0054] 在一個實施方案中解吸液體具有與結(jié)合緩沖液和洗涂緩沖液不同的電導(dǎo)率和/或 pH，比如比結(jié)合緩沖液和洗涂緩沖液更高的電導(dǎo)率。
[0055] 在另一個實施方案中液體制劑含有宿主細(xì)胞蛋白。每當(dāng)生物分子在細(xì)胞中表達(dá)， 細(xì)胞也將表達(dá)其自己的蛋白，通常稱為宿主細(xì)胞蛋白化CP)。運是寬范圍的不同蛋白，取決 于細(xì)胞類型，殘余HCP是經(jīng)常在下游處理時難W除去的雜質(zhì)種類。當(dāng)C冊細(xì)胞用于表達(dá)蛋白 (如單克隆抗體)時，宿主細(xì)胞蛋白有時稱為C冊細(xì)胞蛋白（CHOP)。有效除去HCP/C冊P是期望 的特征。在一個實施方案中在分離步驟將宿主細(xì)胞蛋白濃度減少含5或甚至含10的系數(shù)。在 分離步驟之前和之后測定HCP/CH0P水平的方法是公知的，包括例如免疫測定。
[0056] 在另一個實施方案中將分離基質(zhì)填在柱中。有許多不同的柱構(gòu)造可市售獲得，且 用顆粒形式的分離基質(zhì)填柱的方法在本領(lǐng)域公知。
[0057] 在又一個實施方案中雜質(zhì)與分離基質(zhì)結(jié)合，而在柱的流過物中回收祀生物分子。 該方法經(jīng)常稱為流過(flow-t虹OUgh)層析，得到高生產(chǎn)量，特別是如果雜質(zhì)水平相對低(如 低于10 00化pm)時。
[0058] 在一個實施方案中使分離基質(zhì)顆粒的混懸液與液體制劑接觸，接著從液體制劑除 去分離基質(zhì)顆粒。該方法經(jīng)常用于分批方式，但也可采用連續(xù)方式。在一個實施方案中通過 外力場促進(完成？)分離基質(zhì)顆粒的除去。外力場典型地可W是重力場(其中基質(zhì)顆粒可根 據(jù)密度沉降或漂?。?、離屯、力場、磁場、電場或流體流動力場(如通過過濾除去基質(zhì)顆粒時）。 對于重力場和離屯、力場，可W使用分離基質(zhì)顆粒與周圍液體之間的固有密度差異，但也可 W在分離基質(zhì)顆粒中包括高或低密度填料W增加密度差異。對于磁場，方便的是在分離基 質(zhì)顆粒中包括磁性(如超順磁性)填料。
[0059] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將從W下實施例和從權(quán)利要求顯而易見。
[0060] 本書面描述用實施例公開本發(fā)明，包括最佳實施方式，還使本領(lǐng)域任何技術(shù)人員 能夠?qū)嵤┍景l(fā)明，包括制備和使用任何設(shè)備或系統(tǒng)和執(zhí)行任何并入的方法。本發(fā)明的可專 利范圍由權(quán)利要求限定，可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員想到的其它實施例。此類其它實施例旨在 落入權(quán)利要求范圍內(nèi)，如果它們具有不與權(quán)利要求的文字語言不同的結(jié)構(gòu)元件，或者如果 它們包括與權(quán)利要求的文字語言無實質(zhì)差異的等價結(jié)構(gòu)元件。
[0061] 附圖詳述
[0062] 圖1.對單克隆抗體的動態(tài)結(jié)合容量和陽離子交換池中的HCP水平作為加入基礎(chǔ)基 質(zhì)的正下基量的函數(shù)。
[0063] 圖2.慶大霉素(細(xì)胞培養(yǎng)物的添加劑）的清除率作為加入基礎(chǔ)基質(zhì)的正下基配體 量的函數(shù)。 實施例
[0064] 進料樣品
[0065] 進料是IgG單克隆抗體的蛋白A柱洗出液，在pH 9.2具有其等電點，表達(dá)于CHO細(xì) 胞?？贵w濃度為約5g/L，宿主細(xì)胞蛋白濃度為1600化pm，慶大霉素(細(xì)胞培養(yǎng)物的添加劑)濃 度為約175ng/ml。將進料電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至約4mS/cm。
[0066] 實施例1:在基礎(chǔ)基質(zhì)上具有正下基配體的陽離子交換劑原型
[0067] 將按照US 6,602,990(Berg)描述制備的瓊脂糖凝膠珠（即具有改良的流動/壓力 性質(zhì)的瓊脂糖），通過使用描述于下文合成實施例la)的條件，經(jīng)歷與正下基縮水甘油酸的 反應(yīng)，W將受控疏水性引入基質(zhì)內(nèi)。接著用描述于下文合成實施例1b)的條件，通過瓊脂糖 珠的環(huán)氧活化和葡聚糖偶聯(lián)至所選水平來引入增長劑。最后根據(jù)合成實施例1c)使凝膠與 乙締基橫酸鋼反應(yīng)W將陽離子交換配體引入至期望的水平。
[0068] 合成實施例la)疏水配體的引入
[0069] 使凝膠（125克沉淀)懸浮于水(37.5mL)中，加入硫酸鋼(20.6克），接著在室溫下攬 拌(30分鐘）。向攬拌的漿料內(nèi)加入50 %氨氧化鋼(w/w) (37.5克)和棚氨化鋼(0.52克）的溶 液。將混合物在室溫攬拌1小時，然后加入下基縮水甘油酸(31.25mL)，接著在5(TC另外攬拌 20小時。反應(yīng)完成后加入水(IOOmU，將反應(yīng)混懸液用乙酸中和至中性pH。
[0070] 最后將凝膠在玻璃過濾器上用水，乙醇，然后再用水洗涂。
[0071] 分析用運些特定條件引入的配體水平得到50皿ol/mL沉淀凝膠。
[0072] 合成實施例化)環(huán)氧活化和葡聚糖偶聯(lián)
[0073] 向具有引入的疏水配體的凝膠（120克沉淀）內(nèi)加入水(32.8mL)和50%氨氧化鋼 (w/w)的溶液(36mL)，然后將漿料在室溫攬拌20分鐘。然后，使用劑量儀累，加入表氯醇(總 計40mL，0.33mL/分鐘），接著在室溫另外攬拌2小時。最后將凝膠在玻璃過濾器上用水洗涂。 運些條件得到11皿O VmL沉淀凝膠的環(huán)氧活