用于口服施用的組合物可W是液體或固體?？诜后w制劑可W是例如水性或油性 混懸劑、溶液、乳劑、糖漿劑或馳劑的形式，或者可W被呈現(xiàn)為用于用水或其它合適的媒介 物在使用之前進(jìn)行重構(gòu)的干燥產(chǎn)品?？诜后w制劑可W含有如本領(lǐng)域已知的助懸劑。在口 服固體制劑(諸如粉劑、膠囊劑和片劑)的情況下，可W包括載體諸如淀粉、糖、微晶纖維素、 造粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等。因?yàn)樗鼈円子谑┯?，片劑和膠囊劑代表最有利的口服劑 量單位形式，在該情況下一般采用固體藥學(xué)載體。
[0118] 除了上述常見(jiàn)劑型之外，本發(fā)明的活性劑還可W通過(guò)緩釋手段和/或遞送裝置進(jìn) 行施用。片劑和膠囊劑可W包含常規(guī)載體或賦形劑諸如粘合劑例如糖漿劑、阿拉伯膠、明 膠、山梨糖醇、黃巧膠或聚乙締化咯燒酬;填充劑，例如乳糖、糖、玉米淀粉、憐酸巧、山梨糖 醇或甘氨酸；制錠潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸儀、滑石、聚乙二醇或氧化娃;崩解劑，例如馬鈴馨淀 粉;或可接受的濕潤(rùn)劑諸如十二烷基硫酸鋼。片劑可根據(jù)普通醫(yī)藥實(shí)踐中眾所周知的方法 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)水性或非水性技術(shù)進(jìn)行包衣。適用于口服施用的本發(fā)明的藥物組合物可W被呈現(xiàn) 為離散的單位諸如膠囊劑、扁囊劑或片劑，各自含有預(yù)定量的活性劑，為粉劑或顆粒劑，或 者為水性液體中、非水性液體、水包油乳劑或油包水液體乳劑的溶液或混懸劑。運(yùn)樣的組合 物可W通過(guò)任何藥學(xué)方法進(jìn)行制備，但所有的方法包括將活性劑與載體(其構(gòu)成一種或多 種必需成分)締合的步驟。一般而言，通過(guò)將活性劑與液體載體或精細(xì)分散的固體載體或二 者均勻而充分混合，然后若有必要，將產(chǎn)品成型為所需表現(xiàn)形式(presentation)來(lái)制備組 合物。例如，可W通過(guò)任選地與一種或多種輔助成分壓縮或模制來(lái)制備片劑。
[0119] 適用于腸胃外施用的藥物組合物可W被制備為合適地與表面活性劑(諸如徑丙基 纖維素)在水中混合的本發(fā)明的活性劑的溶液或混懸劑。還可W在甘油、液體聚乙二醇及其 在油中的混合物中制備分散物。在普通存儲(chǔ)和使用條件下，運(yùn)些制劑含有防腐劑W阻止微 生物的生長(zhǎng)。適用于注射用途的藥物形式包括水性或非水性無(wú)菌注射液，其可W含有抗氧 化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得組合物與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)，W及可W包括懸浮劑 和增稠劑(tWckening agent)的水性和非水性無(wú)菌混懸劑?？蒞從無(wú)菌粉劑、顆粒劑和片劑 制備即時(shí)注射液、分散物和混懸劑?？蒞用本領(lǐng)域已知的醫(yī)療裝置施用藥物組合物。例如， 在優(yōu)選實(shí)施方案中，可W用無(wú)針皮下注射裝置施用本發(fā)明的藥物組合物，諸如在US 5，399， 163;5,383,851 ;5,312，335;5,064,413 ;4,941，880;4,790,824或4,596,556 中公開(kāi)的裝置。 本發(fā)明中有用的眾所周知的植入物和模塊的實(shí)例包括:US 4,487,603，其公開(kāi)了用于^控 制速率分散藥物的可植入輸液累;US 4,486,194,其公開(kāi)了用于通過(guò)皮膚施用藥物的治療 裝置;US 4,447,233，其公開(kāi)了用于^精確的輸液速率遞送藥物的藥物輸液累;118 4,447， 224,其公開(kāi)了用于連續(xù)藥物遞送的流速可變的可植入輸液設(shè)備;US 4,439,196,其公開(kāi)了 具有多腔隔室的滲透型藥物遞送體系；W及US 4，475，196，其公開(kāi)了滲透型藥物遞送體系。 許多其它運(yùn)樣的植入物、遞送體系和模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0120] 適用于局部施用的藥物組合物可W被配制為軟膏劑、乳膏、混懸劑、洗劑、粉劑、溶 液、糊劑、凝膠、浸潰敷料、噴霧劑、氣霧劑或油、透皮裝置、撒粉劑(dusting powder)等。運(yùn) 些組合物可W通過(guò)常規(guī)方法制備而含有活性劑。因此，它們還可W包含相容的常規(guī)載體和 添加劑，諸如防腐劑、幫助藥物穿透的溶劑、乳膏或軟膏劑中的潤(rùn)滑藥和用于洗劑的乙醇或 油醇。運(yùn)樣的載體可W存在為組合物的大約1%-大約98%。更通常的是，它們會(huì)形成組合物 的高達(dá)大約80%。僅僅作為示例，通過(guò)混合足夠量的親水性材料和水(含有大約5-10%重量 的化合物)制備乳膏或軟膏劑，其量足夠生產(chǎn)具有所期望的稠度的乳膏或軟膏劑。適用于透 皮施用的藥物組合物可W呈現(xiàn)為離散的貼劑，其預(yù)期與接受者的表皮保持密切接觸持續(xù)延 長(zhǎng)的時(shí)期。例如，活性劑可W從貼劑通過(guò)離子透入而遞送。對(duì)于應(yīng)用于外部組織，例如口和 皮膚，組合物優(yōu)選被施加為局部軟膏劑或乳膏。當(dāng)被配制為軟膏劑時(shí)，活性劑可與石蠟或水 溶性軟膏基質(zhì)一起使用。備選地，活性劑可W用水包油乳膏基質(zhì)或油包水基質(zhì)配制成乳膏。 適用于口中局部施用的藥物組合物包括錠劑(lozenge)、軟錠劑(pastille)和漱口劑。適用 于局部施用至眼的藥物組合物包括滴眼劑，其中活性劑溶解于或懸浮于合適的載體中，特 別是水性溶劑。它們還可W包括如上的局部軟膏劑或乳膏。適用于其中載體是固體的直腸 施用的藥物組合物最優(yōu)選地呈現(xiàn)為單位劑量栓劑。合適的載體包括可可脂或本領(lǐng)域常見(jiàn)使 用的其它甘油醋或材料，并且可W通過(guò)將組合物與軟化或融化的capier混合接著冷卻和成 型模具來(lái)便利地形成栓劑。它們還可W作為灌腸劑施用。
[0121] 待施用的CSF-IR活性抑制劑的劑量將根據(jù)具體的抑制劑、纖維化疾病的類(lèi)型、受 試者、疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重度W及受試者的身體條件、所選擇的施用途徑而發(fā)生變化;適當(dāng)?shù)?劑量可W由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。為了治療和/或預(yù)防人和動(dòng)物中的纖維化疾病，包 含抗體的藥物組合物可W使用任何合適的施用途徑(諸如注射或其它本領(lǐng)域已知的用于臨 床產(chǎn)品（諸如基于抗體的臨床產(chǎn)品）的施用途徑）W治療上或預(yù)防上有效的劑量(例如導(dǎo)致 纖維化疾病的抑制和/或纖維化疾病癥狀的緩解的劑量)施用給患者(例如人受試者）。取決 于施用方法，組合物可W含有至少0.05%重量、例如0.5-50%重量、諸如1-10%重量或更多 重量的本發(fā)明的抑制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的是，將通過(guò)所治療的病況的性質(zhì)和程 度、施用的形式、途徑和部位、W及所治療的特定受試者的年齡和狀況確定本發(fā)明的抑制劑 的個(gè)體劑量的最佳的量和間隔，并且醫(yī)師將最終確定待使用的適當(dāng)劑量。可W適當(dāng)經(jīng)常重 復(fù)該劑量。根據(jù)普通臨床實(shí)踐，如果產(chǎn)生副作用，可W改變或減少劑量的量和/或頻率。
[0122] 在抑制劑是核酸的另一個(gè)實(shí)例中，可W通過(guò)基因療法進(jìn)行施用（參見(jiàn)例如 Hoshida,T.等人，2002 ,Pancreas , 25 : 111-121 ; Ikuno ,Y. 2002 , Invest.Ophthalmol.Vis .Sci.2002 43:2406-2411；Bollard,C,2002, Blood 99:3179-3187;Lee E. ,2001，Mol.Med.7:773-782)。基因療法是指給受試者施用經(jīng)表達(dá)的或可表達(dá) 的核酸，在一個(gè)實(shí)例中，其為CSF-I、比-34或CSF-IR核酸或其部分?？蒞根據(jù)本發(fā)明使用本 領(lǐng)域中可得的用于基因療法的任何方法。將治療核酸遞送進(jìn)入患者可W是直接的體內(nèi)基因 療法(即患者直接暴露于核酸或者含有核酸的載體)或者間接的離體基因療法(即細(xì)胞首先 用核酸體外轉(zhuǎn)化，然后移植入患者）。例如，對(duì)于體內(nèi)基因療法，可W將含有CSF-1、IL-34或 CSF-IR核酸的表達(dá)載體W它變成細(xì)胞內(nèi)的方式進(jìn)行施用，即通過(guò)使用如US 4,980，286或 Robbins等人，1998 Jharmacol. Ther. 80:35-47中所述的缺陷型或減毒逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它 病毒載體進(jìn)行感染。本領(lǐng)域已知的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是諸如在Miller等人（1993， Meth.En巧mol. 217:581-599)中所述的那些，其已經(jīng)被修飾W缺失病毒基因組的包裝所不 需要的那些逆轉(zhuǎn)錄病毒序列并隨后整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA。還可W使用腺病毒載體，其是有 利的，因?yàn)樗鼈兡軌蚋腥痉欠至训募?xì)胞，運(yùn)樣的高容量腺病毒載體被描述于Kochanek (1999,Human Gene Therapy, 10:2451-2459)中?？?W使用的嵌合病毒載體是由Reynolds等 人（1999,MoIecular Medicine Today, 1:25-31)所述的那些。還可W使用雜合載體，它們由 化COby等人（1997,Gene Ilierapy,4:1282-1283)描述。在基因療法中還可W使用裸露的DNA 的直接注射，或者通過(guò)使用微粒轟擊(例如基因槍(R) ;Biolistic,Dupont)或者通過(guò)用脂質(zhì) 涂覆它。可W使用細(xì)胞表面受體/轉(zhuǎn)染化合物或者通過(guò)包封于脂質(zhì)體、微粒或微囊中或者通 過(guò)施用與已知進(jìn)入細(xì)胞核的膚連接的核酸或者通過(guò)施用與對(duì)受體介導(dǎo)的胞吞作用易感的 配體連接的核酸（參見(jiàn)Wu和Wu，1987，J. Bio 1.化em .，262:4429-4432)來(lái)祀向特異性表達(dá)感 興趣的受體的細(xì)胞類(lèi)型。在離體基因療法中，在體外使用組織培養(yǎng)將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，并 將細(xì)胞通過(guò)各種方法(諸如皮下注射，將細(xì)胞施加進(jìn)入皮膚移植物W及靜脈注射重組血細(xì) 胞諸如造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)遞送至患者?？蒞將CSF-I、比-34或CSF-IR核酸引入其中用于 基因療法目的的細(xì)胞包括例如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝 細(xì)胞和血細(xì)胞?？蒞使用的血細(xì)胞包括例如T淋己細(xì)胞、B淋己細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨隧細(xì)胞、中 性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞、造血細(xì)胞或祖細(xì)胞等。
[0123] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物包含CSF-I、比-34或CSF-IR核酸，所述核酸是表 達(dá)載體的一部分，所述表達(dá)載體在合適的宿主中表達(dá)CSF-I、化-34或CSF-IR多膚或其嵌合 蛋白。特別地，運(yùn)樣的核酸具有可操作地連接至多膚編碼區(qū)的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型 的或組成型的(并且任選地是組織特異性的）。
[0124] 現(xiàn)在，本發(fā)明將通過(guò)引用W下實(shí)施例的方式進(jìn)行記載，所述實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性 的，而不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
【附圖說(shuō)明】
[01巧]圖IA顯示人CSF-IR的氨基酸序列
[0126] 圖IB顯示CSF-IR的某些變體的氨基酸序列
[0127] 圖IC顯示適用于在細(xì)胞表面表達(dá)的CSF-IR的氨基酸序列
[0128] 圖2顯示流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，其證實(shí)通過(guò)該方法可檢測(cè)M-NFS-60細(xì)胞上的結(jié)合受體 的CSF-I
[0129] 圖3顯示在不存在所使用的濃度的CSF-I的情況下，Ab535(固定在組織培養(yǎng)孔的表 面上或游離于溶液中）不支持M-NFS-60細(xì)胞的增殖
[0130] 圖4a顯示與用同種型對(duì)照處理相比，Ab535對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的處理減 少BAL流體膠原的量。
[0131] 圖4b顯示與用同種型對(duì)照處理相比，Ab535對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的處理減 少樣品的艾氏評(píng)分，運(yùn)證實(shí)用Ab535處理的小鼠具有改善的纖維化病理學(xué)。
[0132] 圖4c顯示與用同種型對(duì)照處理相比，Ab535對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的處理減 少BAL流體中白蛋白的量，運(yùn)因此顯示用Ab535處理的小鼠的肺屏障的完整性得到改善。
[0133] 圖4d顯示Ab535對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的處理減少BAL流體中巨隧細(xì)胞的數(shù) 目。
[0134] 圖5顯示來(lái)自鹽水對(duì)照、博來(lái)霉素+同種型對(duì)照和博來(lái)霉素+Ab535處理的動(dòng)物的肺 的病理組織學(xué)分析的代表圖像。與同種型對(duì)照、博來(lái)霉素處理的動(dòng)物相比，用Ab535處理的 動(dòng)物具有極大減少的肺纖維化。
[013引圖6a顯示與用同種型對(duì)照處理相比，Ab535對(duì)患有誘導(dǎo)肺纖維化的ADA缺陷小鼠的 處理降低BALF膠原濃度。
[0136] 圖6b顯示與用同種型對(duì)照處理相比，Ab535對(duì)患有誘導(dǎo)肺纖維化的ADA缺陷小鼠的 處理減少樣品的艾氏評(píng)分，運(yùn)證實(shí)用Ab535處理的小鼠具有改善的纖維化病理學(xué)。
[0137] 圖6c顯示與用同種型對(duì)照處理相比，Ab535對(duì)患有誘導(dǎo)肺纖維化的ADA缺陷小鼠的 處理減少BAL中白蛋白的量，運(yùn)證實(shí)用Ab535處理的小鼠的肺屏障的完整性得到改善。
[013引圖6d顯示Ab535對(duì)患有誘導(dǎo)肺纖維化的ADA缺陷小鼠的處理減少BAL流體中巨隧細(xì) 胞的數(shù)目。
[0139] 圖7顯示來(lái)自用Ab535或者同種型對(duì)照抗體(小鼠IgGl)處理的ADA敲除小鼠和野生 型小鼠的肺組織的病理組織學(xué)分析的代表圖像。用馬森S色染劑(Masson's化ichrome)對(duì) 肺組織切片進(jìn)行染色。Ab535對(duì)ADA敲除小鼠的處理極大減少纖維化組織和膠原沉積的量。 實(shí)施例 巧140] 實(shí)施例1抗小鼠 CSF-IR抗體的分離
[0141] 2只兔子接受采用瞬時(shí)表達(dá)小鼠 CSF-IR化niprot條目P09581)的第1-512位殘基的 細(xì)胞的5次免疫。使用Nunc Maxiso巧板W化ISA監(jiān)測(cè)抗體應(yīng)答，所述板用化g/ml小鼠 CSF-IR-兔化進(jìn)行包被。兩只兔子均觀察到血清滴度超出1:100,000的稀釋度。還通過(guò)FACS測(cè)定 血清與M-NFS-60細(xì)胞的結(jié)合(Metcalf等人，1970)。將中位化1針對(duì)抗體稀釋度進(jìn)行繪制。觀 察到超出1:10，000的稀釋度的結(jié)合。
[0142] 使用CSF-I依賴性M-NFS-60細(xì)胞系(Metcalf等人，1970)，結(jié)果顯示來(lái)自兩只兔子 的血清均能夠在超出1:100的稀釋度上阻斷CSF-I依賴性細(xì)胞的存活(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0143] 將一百個(gè)96孔板每孔接種1000-5000個(gè)兔PBMC，并在化4-B5小鼠胸腺瘤細(xì)胞和兔T 細(xì)胞條件培養(yǎng)基(TSN)的存在下在37C生長(zhǎng)1周。然后使用M-NFS-60細(xì)胞和抗兔Fc特異性切5 綴合物在FMAT測(cè)定中篩選含有抗體的上清。鑒定了 678個(gè)CSF-IR結(jié)合物。運(yùn)些中的約3 %阻 斷細(xì)胞測(cè)定中的CSF-I依賴性M-NFS-60增殖。還使用包被化g/ml CSF-IR-兔化的板在化ISA 中篩選結(jié)合物，用抗兔F(ab'）2-HRP綴合物來(lái)顯示結(jié)合。還在基于化ISA的固相阻斷測(cè)定中 篩選結(jié)合物。對(duì)于該測(cè)定，將Nunc Maxisorp 384孔板用0.扣g/ml CSF-IR-兔化包被，隨后 中PBS/0.1 %Tween-20/l %陽(yáng)G20000中封閉。在培養(yǎng)之前洗涂板，然后將上清加入板并室溫 解育〉1小時(shí)。然后將CSF-I加入上清，終濃度為lOng/ml，并室溫再解育1小時(shí)。洗涂板，然后 用0.扣g/ml生物素化山羊抗小鼠 CSF-I抗體(R&D systems)進(jìn)行解育。使用鏈霉抗生物素蛋 白-HRP顯示CSF-I結(jié)合至受體。選擇八個(gè)孔繼續(xù)進(jìn)行。全都證實(shí)結(jié)合至細(xì)胞和蛋白質(zhì)并在M-NFS-60測(cè)定中和在化ISA中阻斷。
[0144] 使用基于巧光的方法鑒定來(lái)自陽(yáng)性孔的抗原特異性B細(xì)胞。將來(lái)自陽(yáng)性孔的分泌 免疫球蛋白的B細(xì)胞與鏈霉抗生物素蛋白珠混合，所述珠包被生物素化的小鼠 CSF-IR-兔化 和山羊F(ab'）2抗兔F(ab'）2片段特異性FITC綴合物(Jackson ImmunoResearch) d37C解育 1 小時(shí)后，從抗原特異性B細(xì)胞分泌的抗體被捕獲于在該B細(xì)胞附近的珠上。FITC綴合物的存 在導(dǎo)致包被抗體的珠的標(biāo)記和抗原特異性B細(xì)胞周?chē)晒饨裹c(diǎn)的形成。然后用微操縱器挑 取運(yùn)些使用巧光顯微鏡鑒定的個(gè)體B細(xì)胞，并沉積于PCR管中。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR從單個(gè) 細(xì)胞恢復(fù)抗體可變區(qū)基因。然后在CHO瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中將兔V區(qū)表達(dá)為人IgG4嵌合抗體或 化b。8個(gè)孔中有4個(gè)孔產(chǎn)生重組抗CSF-IR抗體。然后在M-NFS-60測(cè)定中確認(rèn)使用重組抗體的 中和活性。還使用化b分子進(jìn)行BIAcoreW確定CSF-IR兔化的親和力(表1)?；谥泻突钚院?親和力，將Ab535選擇為抗小鼠 CSF-IR試劑。隨后將該抗體鼠源化(murinised)并在哺乳動(dòng) 物系統(tǒng)中表達(dá)為全長(zhǎng)鼠 IgGl并進(jìn)行純化。
[0145] BIAcore 方法
[0146] 在BIAcore測(cè)定中通過(guò)測(cè)量針對(duì)純化的重組CSF-IR/Fc融合蛋白的結(jié)合動(dòng)力學(xué)測(cè) 試抗體結(jié)合CSF-IR的能力。
[0147] 測(cè)定形式是通過(guò)固定化的抗人IgG, F(ab'）2捕獲抗CSF-IR抗體然后滴定在捕獲表 面上的hCSF-lR/Fc。使用BIAcore 3000(GE Healthcare Bio-Sciences AB)進(jìn)行BIA(生物 分子相互作用分析(Biamolecular Interaction Analysis))。在25°C進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。將特 異性的Affinipure F(ab'）2片段山羊抗人IgG,F(ab'）2片段(Jackson ImmunoResearch)經(jīng) 由胺偶聯(lián)化學(xué)固定在CMSSensor Qiip(GE Healthcare Bio-Sciences AB)上至~6000應(yīng)答 單位(抓）的水平。將皿S-EP緩沖液（IOmM 肥陽(yáng)S pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005%表 面活性劑P20,GE Healthcare Bio-Sciences AB)用作運(yùn)行緩沖液，流速為lOul/min。進(jìn)行 抗CSF-IR抗體的注射W在固定化的抗人IgG, F(ab)2上產(chǎn)生約IOORU的捕獲水平。
[014引通過(guò)在捕獲的抗CSF-IR抗體上通過(guò)倍比稀釋從2.5nM至78pMW30iil/min的流速持 續(xù)3min隨后進(jìn)行Smin的解離相來(lái)滴定重組人CSF-IR/化(R&D Systems)。將運(yùn)些傳感圖用于 生成締合速率。通過(guò)40mM HCl的兩個(gè)連續(xù)的1 Oiil注射液隨后1 OmM化OH的化1注射液W1 Oy Vmin的流速再生表面。使用BIA評(píng)估軟