高純度4-羥基環(huán)孢素及其提純制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域,尤其涉及利用生物轉(zhuǎn)化法制得4-羥基環(huán)孢素發(fā)酵液 后再提取制備高純度4-羥基環(huán)孢素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 4-羥基環(huán)孢素(簡稱4-OH環(huán)孢素)是新型抗丙肝病毒藥物的重要醫(yī)藥中間體, 主要針對丙型病毒性肝炎,簡稱為丙型肝炎、丙肝,是一種由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,目前全球HCV的感染率約為 3 %,估計約1. 8億人感染了 HCV,每年新發(fā)丙型肝炎病例約為3. 5萬例。丙型肝炎呈全球性 流行,可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化,部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至細(xì)胞癌(HCC)。一 些數(shù)據(jù)顯示,未來20年內(nèi)與HCV感染相關(guān)的死亡率將持續(xù)增長,對患者的健康和生命危害 極大,已成為嚴(yán)重的社會的公共衛(wèi)生問題。4-OH環(huán)孢素是合成新型抗丙肝病毒藥物重要的 醫(yī)藥中間體。
[0003] 4-OH環(huán)孢素結(jié)構(gòu)式:
[0004]
[0005] 4-OH環(huán)孢素發(fā)酵產(chǎn)品中的主要雜質(zhì)是未轉(zhuǎn)化的環(huán)孢菌素及其同系物,其去除難度 高,經(jīng)檢索未發(fā)現(xiàn)有如何去除這些雜質(zhì)以得到高純度的4-OH環(huán)孢素的相關(guān)文獻(xiàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的是在于提供一種高純度4-OH環(huán)孢素及其提純制備方法,以達(dá)到低 成本、高效率的提純4-OH環(huán)孢素。
[0007] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0008] 高純度4-羥基環(huán)孢素的提純制備方法,包括如下步驟:
[0009] (1) 4-羥基環(huán)孢素的提取
[0010] 向4-羥基環(huán)孢素發(fā)酵液中加入有機(jī)溶劑,常溫下浸提2至4小時,濾出菌體得浸 提液;
[0011] ⑵脫色介質(zhì)脫色
[0012] 脫色介質(zhì)裝柱,浸提液用脫色柱進(jìn)行脫色處理,得到脫色液;
[0013] (3)吸附介質(zhì)富集
[0014] 脫色液用吸附介質(zhì)進(jìn)行吸附富集,洗滌劑處理上樣后的吸附介質(zhì),然后用解析劑 進(jìn)行解析并收集解析液,解析液濃縮后用乙酸乙酯萃取,將乙酸乙酯相濃縮待用;
[0015] (4)高壓層析制備
[0016] 將乙酸乙酯濃縮液進(jìn)行高壓層析制備,用乙腈水混合溶劑洗脫,收集4-羥基環(huán)孢 素;
[0017] (5)結(jié)晶純化
[0018] 4-羥基環(huán)孢素經(jīng)濃縮,萃取后進(jìn)行結(jié)晶,結(jié)晶液放置,直至目測出現(xiàn)晶體析出,抽 濾結(jié)晶液,用異丙醚洗滌,最后干燥得無色粉末狀4-羥基環(huán)孢素精粉。
[0019] 本發(fā)明中,步驟(1)中所用有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或多種,所用 有機(jī)溶劑用量與發(fā)酵液體積比為1:1 _1: 2。
[0020] 本發(fā)明中,步驟(2)中所用脫色介質(zhì)為陰離子交換樹脂D290、RX-01T或RX-02T ; 步驟(3)中所用吸附介質(zhì)為大孔吸附樹脂HZ830、HZ801或HZ816。
[0021] 本發(fā)明中,步驟(3)中所用洗滌劑依次為45%甲醇一堿(lg/L NaOH)、45%甲醇; 所用解析劑為80% -85%甲醇。
[0022] 本發(fā)明中,步驟(4)中所用填料為120A ΙΟμπι C18。
[0023] 本發(fā)明中,步驟(4)中所用流動相配比為乙腈:水=50~70 :50~30。
[0024] 本發(fā)明中,步驟(4)中所用流動相配比為乙腈:水=65:35。
[0025] 本發(fā)明中,步驟(5)中所用結(jié)晶劑為丙酮:異丙醚=0~10:100~90。
[0026] 本發(fā)明中,步驟(5)中所用結(jié)晶劑為丙酮:異丙醚=5:95。
[0027] 本發(fā)明中,步驟(5)中4-羥基環(huán)孢素的真空干燥溫度為40-65Γ。
[0028] 本發(fā)明的4-羥基環(huán)孢素 XRD圖如圖2所示。
[0029] 本發(fā)明采用離子交換樹脂脫色,大孔吸附樹脂富集,高壓層析純化的方法,各階段 選擇特定工藝并互相配合取得了良好的技術(shù)效果。本發(fā)明采用陰離子樹脂脫色技術(shù),有效 去除了浸提液中的色素,為之后的純化工作降低了難度;采用大孔吸附樹脂層析技術(shù),對 4-OH環(huán)孢素起到了明顯的濃縮富集作用,4-OH環(huán)孢素的濃度經(jīng)富集可提高近25倍。采用高 壓層析技術(shù),大大縮短了工藝周期,現(xiàn)有的常壓硅膠層析方法周期長,約為3-5天左右,載 樣量為0. 5%,溶劑使用量約為20倍柱體積,且所使用洗脫劑為混合有機(jī)溶劑,不易回收和 重復(fù)利用;高壓層析方法周期短,約為1-2小時左右,載樣量為1 %,溶劑使用量約為10倍 柱體積,所使用溶劑為乙腈、水,易于回收,降低了使用洗脫劑成本,大大節(jié)省了生產(chǎn)周期。 使用單一有機(jī)溶劑及水作為流動相,較常壓硅膠層析使用混合有機(jī)溶劑易于溶媒的回收, 節(jié)約了成本。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明的4-OH環(huán)孢素的提純工藝路線圖。
[0031] 圖2為4-OH環(huán)孢素精粉的XRD圖。
[0032] 圖3為4-OH環(huán)孢素精粉的DSC圖。
[0033] 圖4為4-OH環(huán)孢素精粉的TGA圖。
[0034] 圖5為4-OH環(huán)孢素精粉的拉曼光譜圖。
[0035] 圖6為4-OH環(huán)孢素精粉的紅外光譜圖。
[0036] 圖7為實(shí)施例1制得的4-OH環(huán)孢素精粉的的高壓液相色譜圖。
[0037] 圖8為實(shí)施例2制得的4-OH環(huán)孢素精粉的的高壓液相色譜圖。
[0038] 圖9為實(shí)施例3制得的4-OH環(huán)孢素精粉的的高壓液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 本發(fā)明所使用高壓液相設(shè)備為江蘇漢邦科技有限公司產(chǎn)品,檢測器:NU3000 SERIALS UN/VIS DETECTOR,輸液栗:NP7000 SERIALS PUMB,柱:DAC-HB 動態(tài)軸向壓縮柱。
[0040] 下面結(jié)合圖1,對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明:
[0041] 本發(fā)明第⑴步進(jìn)行4-OH環(huán)孢素的提取:
[0042] 向4-OH環(huán)孢素發(fā)酵液中加入有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或多種,優(yōu) 選為甲醇,常溫下浸提2至4小時,濾出菌體得浸提液。
[0043] 本發(fā)明第(2)步利用脫色介質(zhì)脫色:
[0044] 脫色介質(zhì)裝柱,浸提液用脫色柱進(jìn)行脫色處理,得到脫色液。
[0045] 對不同型號樹脂進(jìn)行了 4-OH環(huán)孢素動態(tài)脫色實(shí)驗,確定了 D290、RX-01T和RX-02T 脫色效果較好,且對4-OH環(huán)孢素?zé)o吸附,其中優(yōu)選RX-02T樹脂。
[0046] 本發(fā)明第(3)步利用吸附介質(zhì)富集:
[0047] 脫色液用吸附介質(zhì)進(jìn)行吸附富集,洗滌劑處理上樣后的吸附介質(zhì),然后用解析劑 進(jìn)行解析并收集解析液,解析液濃縮后用乙酸乙酯萃取,將乙酸乙酯相濃縮待用。
[0048] 對不同型號樹脂進(jìn)行了 4-OH環(huán)孢素靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗,確定了 HZ830、HZ801和 HZ816的吸附和解吸效果較好,其中優(yōu)選HZ816樹脂。
[0049] 上樣后的樹脂洗滌劑依次為45%甲醇一堿(lg/L NaOH)、45%甲醇,經(jīng)實(shí)驗驗證使 用45 %甲醇一堿(1 g/L NaOH)(向洗滌劑45 %甲醇中按1 g/L加入NaOH使得每升45 %甲醇 中含有l(wèi)g NaOH)作洗滌劑,可以更有效的去除吸附在樹脂上的雜質(zhì),乙酸乙酯相濃縮后的 粗品含量更高,有效降低了后期純化步驟的壓力。
[0050] 洗滌后的樹脂洗脫劑為80% -85%甲醇,優(yōu)選85%甲醇,洗脫體積約為1. 5~2倍 柱體積。
[0051] 本發(fā)明第⑷步高壓層析制備:
[0052] 將乙酸乙酯濃縮液進(jìn)行高壓層析制備,用乙腈水混合溶劑洗脫,收集合格的4-OH 環(huán)孢素。
[0053] 高壓層析選用C18填料,粒徑10 μπι,孔徑120A,所用流動相配比為乙腈:水= 50~70 :50~30,優(yōu)選乙腈:水=65:35,當(dāng)柱床體積為300ml時,上樣液為20ml,4-0Η環(huán) 孢素上樣濃度為4 X 105-5 X ΙΟ5 μ g/ml,優(yōu)選5 X ΙΟ5 μ g/ml,洗脫流速為50-90ml/min,優(yōu)選 80ml/min,用HPLC檢測流出液,收集合格產(chǎn)品。
[0054] 本發(fā)明第(5)步結(jié)晶純化:
[0055] 合格部分經(jīng)濃縮,萃取后進(jìn)行結(jié)晶,結(jié)晶液放置,直至目測出現(xiàn)晶體析出,抽濾結(jié) 晶液,用異丙醚洗滌,最后干燥得無色粉末狀4-OH環(huán)孢素精粉。
[0056] 洗脫液在50°C -60°C條件下減壓濃縮至干,加入少量結(jié)晶劑,結(jié)晶劑配比為丙酮: 異丙醚=0~10:100~90,優(yōu)選丙酮:異丙醚=5:95,置于室溫條件下結(jié)晶,用異丙醚洗滌 后40°C -60°C條件下干燥至恒重。
[0057] 實(shí)施例1
[0058] 1)取4-OH環(huán)孢素發(fā)酵液30L,含4-OH環(huán)孢素10. 2g,加入30L異丙醇浸泡5小時, 板框過濾,收集浸提液58L,效價為173 μ g/ml。
[0059] 2)將收集到的浸提液,用1L D290樹脂作為脫色介質(zhì)進(jìn)行脫色,流速為2BV/h,收 集脫色液,脫色液明顯較上柱前淺。
[0060] 3)將收集到的脫色液,使用1L HZ816柱進(jìn)行吸附,上樣流速為lBV/h,吸附完畢后 檢測下柱液效價為lμg/ml,廢