棄。吸附后的樹(shù)脂經(jīng)一步洗滌，洗滌劑為45%甲醇，流速均 為1~1. 5BV/h，經(jīng)檢測(cè)洗柱液均無(wú)單位。再用80 %異丙醇解析，流速為lBV/h，分段收集 解析液。解析液出口單位小于10 μ g/ml時(shí)，解析完成，合并有效部分，進(jìn)行減壓濃縮，真空 度0. 09Mpa以上，溫度控制不超過(guò)55°C，加入2L乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4-OH環(huán)孢素轉(zhuǎn)入乙酸 乙酯相，乙酸乙酯相進(jìn)行減壓濃縮，真空度-0. 〇9Mpa以上，溫度控制不超過(guò)55°C，濃縮至乙 酸乙酯盡干得4-OH環(huán)孢素油膏。
[0061] 4)將得到的4-OH環(huán)孢素油膏用少量乙腈溶解，進(jìn)行高壓層析制備，流動(dòng)相為50% 乙腈，分段收集流出液，經(jīng)分析檢測(cè)后收集合格部分。
[0062] 5)將收集到的檢測(cè)合格的洗脫液減壓濃縮，真空度0. 09Mpa以上，溫度控制不超 過(guò)55°C，得到4-OH環(huán)孢素濃縮液。加入1L乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4-OH環(huán)孢素轉(zhuǎn)入乙酸乙酯 相。再將乙酸乙酯相進(jìn)行減壓濃縮，真空度0. 〇9Mpa以上，溫度控制不超過(guò)55°C，濃縮至乙 酸乙酯盡干得4-OH環(huán)孢素濃縮物。將得到的4-OH環(huán)孢素濃縮物用100ml結(jié)晶溶劑（結(jié)晶 溶劑為丙酮：異丙醚=10:90)溶解，攪拌狀態(tài)下放置，直至有晶體析出，過(guò)濾結(jié)晶液，用異 丙醚挖洗，得到濕精粉。濕精粉放入真空烤箱，在50°C，0. 09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24 小時(shí)，得到無(wú)定形4-OH環(huán)孢素精粉。HPLC測(cè)定如圖7,4-OH環(huán)孢素的純度達(dá)到了 97%。其 XRD圖如圖2所示，DSC圖如圖3所示、TGA圖如圖4所示、拉曼光譜圖如圖5所示，紅外光 譜圖如圖6所示。
[0063] 實(shí)施例2
[0064] 1)取4-OH環(huán)孢素發(fā)酵液25L，含4-OH環(huán)孢素8. 2g，加入20L乙醇浸泡5小時(shí)，板 框過(guò)濾，收集浸提液41L，效價(jià)為189 μ g/ml。
[0065] 2)將收集到的浸提液，用1L RX-01T樹(shù)脂作為脫色介質(zhì)進(jìn)行脫色，流速為2BV/h， 收集脫色液，脫色液明顯較上柱前淺。
[0066] 3)將收集到的脫色液，使用1L HZ816柱進(jìn)行吸附，上樣流速為lBV/h，吸附完畢后 檢測(cè)下柱液效價(jià)為1 μ g/ml，廢棄。吸附后的樹(shù)脂經(jīng)兩步洗滌，洗滌劑1為45%甲醇-堿 (lg/L NaOH)，洗滌劑2為45%甲醇，流速均為1~1. 5BV/h，經(jīng)檢測(cè)洗柱液均無(wú)單位。再用 82%乙醇解析，流速為lBV/h，分段收集解析液。解析出口單位小于10 μ g/ml時(shí)，解析完成， 合并有效部分。將收集到的解吸液，進(jìn)行減壓濃縮，真空度〇.〇9Mpa以上，溫度控制不超過(guò) 55°C，加入2L乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4-OH環(huán)孢素轉(zhuǎn)入乙酸乙酯相，乙酸乙酯相進(jìn)行減壓濃縮， 真空度0. 09Mpa以上，溫度控制不超過(guò)55°C，濃縮至乙酸乙酯盡干得4-OH環(huán)孢素油膏。
[0067] 4)將得到的4-OH環(huán)孢素油膏用少量乙腈溶解，進(jìn)行高壓層析制備，流動(dòng)相為70% 乙腈，分段收集流出液，經(jīng)分析檢測(cè)后收集合格部分。
[0068] 5)將收集到的檢測(cè)合格的洗脫液減壓濃縮，真空度0. 09Mpa以上，溫度控制不超 過(guò)55°C，得到4-OH環(huán)孢素濃縮液。加入1L乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4-OH環(huán)孢素轉(zhuǎn)入乙酸乙酯 相。再將乙酸乙酯相進(jìn)行減壓濃縮，真空度0. 〇9Mpa以上，溫度控制不超過(guò)60°C，濃縮至乙 酸乙酯盡干得4-OH環(huán)孢素濃縮物。將得到的4-OH環(huán)孢素濃縮物用100ml結(jié)晶溶劑（結(jié)晶 溶劑為丙酮：異丙醚=2:98)溶解，攪拌狀態(tài)下放置，直至有晶體析出，過(guò)濾結(jié)晶液，用異丙 醚挖洗，得到濕精粉。濕精粉放入真空烤箱，在40-60°C，0. 09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24 小時(shí)，得到無(wú)定形4-OH環(huán)孢素精粉，HPLC測(cè)定如圖8,4-OH環(huán)孢素的純度達(dá)到了 98. 3%。
[0069] 實(shí)施例3
[0070] 1)取4-OH環(huán)孢素發(fā)酵液28L，含4-OH環(huán)孢素9. 8g，加入25L甲醇浸泡5小時(shí)，板 框過(guò)濾，收集浸提液50L，效價(jià)為185 μ g/ml。
[0071] 2)將收集到的浸提液，用1L RX-02T樹(shù)脂作為脫色介質(zhì)進(jìn)行脫色，流速為2BV/h， 收集脫色液，脫色液明顯較上柱前淺。
[0072] 3)將收集到的脫色液，使用1L HZ816柱進(jìn)行吸附，上樣流速為lBV/h，吸附完畢后 檢測(cè)下柱液效價(jià)為3 μ g/ml，廢棄。吸附后的樹(shù)脂經(jīng)兩步洗滌，洗滌劑1為45%甲醇-堿 (lg/L NaOH)，洗滌劑2為45%甲醇，流速均為1~1. 5BV/h，經(jīng)檢測(cè)洗柱液均無(wú)單位。再用 80% -85%甲醇解析，流速為lBV/h，分段收集解析液。解析出口單位小于10 μ g/ml時(shí)，解 析完成，合并有效部分。將收集到的解吸液，進(jìn)行減壓濃縮，真空度〇. 〇9Mpa以上，溫度控制 不超過(guò)55°C，加入2L乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4-OH環(huán)孢素轉(zhuǎn)入乙酸乙酯相，乙酸乙酯相進(jìn)行減 壓濃縮，真空度-0. 〇9Mpa以上，溫度控制不超過(guò)55°C，濃縮至乙酸乙酯盡干得4-OH環(huán)孢素 油膏。
[0073] 4)將得到的4-OH環(huán)孢素油膏用少量乙腈溶解，進(jìn)行高壓層析制備，流動(dòng)相為65% 乙腈，分段收集流出液，經(jīng)分析檢測(cè)后收集合格部分。
[0074] 5)將收集到的檢測(cè)合格的洗脫液減壓濃縮，真空度0. 09Mpa以上，溫度控制不超 過(guò)55°C，得到4-OH環(huán)孢素濃縮液。加入1L乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4-OH環(huán)孢素轉(zhuǎn)入乙酸乙酯 相。再將乙酸乙酯相進(jìn)行減壓濃縮，真空度0. 〇9Mpa以上，溫度控制不超過(guò)55°C，濃縮至乙 酸乙酯盡干得4-OH環(huán)孢素濃縮物。將得到的4-OH環(huán)孢素濃縮物用80ml結(jié)晶溶劑（結(jié)晶 溶劑為丙酮：異丙醚=5:95)溶解，攪拌狀態(tài)下放置，直至有晶體析出，過(guò)濾結(jié)晶液，用異丙 醚挖洗，得到濕精粉。濕精粉放入真空烤箱，在40-60°C，0. 09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24 小時(shí)，得到無(wú)定形4-OH環(huán)孢素精粉，HPLC測(cè)定如圖9,4-OH環(huán)孢素的純度達(dá)到了 99. 2%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 高純度4-羥基環(huán)孢素的提純制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 4-羥基環(huán)孢素的提取 向4-羥基環(huán)孢素發(fā)酵液中加入有機(jī)溶劑，常溫下浸提2至4小時(shí)，濾出菌體得浸提液； (2) 脫色介質(zhì)脫色 脫色介質(zhì)裝柱，浸提液用脫色柱進(jìn)行脫色處理，得到脫色液； (3) 吸附介質(zhì)富集 脫色液用吸附介質(zhì)進(jìn)行吸附富集，洗滌劑處理上樣后的吸附介質(zhì)，然后用解析劑進(jìn)行 解析并收集解析液，解析液濃縮后用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯相濃縮待用； (4) 高壓層析制備 將乙酸乙酯濃縮液進(jìn)行高壓層析制備，用乙腈水混合溶劑洗脫，收集4-羥基環(huán)孢素； (5) 結(jié)晶純化 所得4-羥基環(huán)孢素經(jīng)濃縮，萃取后進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶液放置，直至目測(cè)出現(xiàn)晶體析出，抽 濾結(jié)晶液，用異丙醚洗滌，最后干燥得無(wú)色粉末狀4-羥基環(huán)孢素精粉。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中所用洗滌劑依次為45%甲醇一 堿（lg/L NaOH)、45%甲醇；所用解析劑為80%-85%甲醇。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中所用填料為120A 10 μ m C18。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中所用流動(dòng)相配比為乙腈：水 =50~70 :50~30。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中所用流動(dòng)相配比為乙腈：水 =65:35〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（5)中所用結(jié)晶劑為丙酮：異丙醚 =0 ~10:100 ~90 〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（5)中所用結(jié)晶劑為丙酮：異丙醚 =5:95〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（5)中4-羥基環(huán)孢素的真空干燥溫度 為 40-65 °C。 9. 4-羥基環(huán)孢素，其特征在于其XRD圖如圖2所示。 10. 4-羥基環(huán)孢素，其特征在于制備方法包括以下步驟： (1) 4-羥基環(huán)孢素的提取 向4-羥基環(huán)孢素發(fā)酵液中加入有機(jī)溶劑，常溫下浸提2至4小時(shí)，濾出菌體得浸提液； (2) 脫色介質(zhì)脫色 脫色介質(zhì)裝柱，浸提液用脫色柱進(jìn)行脫色處理，得到脫色液； (3) 吸附介質(zhì)富集 脫色液用吸附介質(zhì)進(jìn)行吸附富集，洗滌劑處理上樣后的吸附介質(zhì)，然后用解析劑進(jìn)行 解析并收集解析液，解析液濃縮后用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯相濃縮待用； (4) 高壓層析制備 將乙酸乙酯濃縮液進(jìn)行高壓層析制備，用乙腈水混合溶劑洗脫，收集4-羥基環(huán)孢素； (5) 結(jié)晶純化 所得4-羥基環(huán)孢素經(jīng)濃縮，萃取后進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶液放置，直至目測(cè)出現(xiàn)晶體析出，抽 濾結(jié)晶液，用異丙醚洗滌，最后干燥得無(wú)色粉末狀4-羥基環(huán)孢素精粉。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種高純度4-羥基環(huán)孢素及其提純制備方法，包括如下步驟：？4-羥基環(huán)孢素的提??；脫色介質(zhì)脫色；吸附介質(zhì)富集；高壓層析制備；結(jié)晶純化。本發(fā)明采用離子交換樹(shù)脂脫色，大孔吸附樹(shù)脂富集，高壓層析純化的方法，各階段選擇特定工藝并互相配合取得了良好的技術(shù)效果。
【IPC分類(lèi)】C07K1/16, C07K7/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105646672
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】魏增輝, 胡帥珂, 劉瑩, 王喬波, 董國(guó)豪, 康志飛, 劉建明, 張志軍
【申請(qǐng)人】石家莊中天生物技術(shù)有限責(zé)任公司, 河北鯤翔濟(jì)世醫(yī)藥科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2014年12月4日