猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法及抗原技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及猴MeV病毒 抗體的免疫梳檢測方法及其檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 麻疹是由麻疹病毒(Measles virus，MeV)引起的一種人等靈長目動(dòng)物急性傳染 病，是猴場須嚴(yán)格控制的疾病之一。一旦爆發(fā)，其蔓延速度快，而且難以控制。麻疹病毒是一 種穩(wěn)定的單型病毒，難以徹底清除，從而干擾實(shí)驗(yàn)研究。近年來，我國實(shí)驗(yàn)猴飼養(yǎng)量快速發(fā) 展，總數(shù)在二十萬以上，實(shí)驗(yàn)猴的進(jìn)出口貿(mào)易量在逐年增加。隨著國際市場對實(shí)驗(yàn)猴質(zhì)量的 要求不斷提高，麻疹病毒己成為大多數(shù)進(jìn)口國要求的必檢項(xiàng)目。
[0003] 免疫梳方法是能夠?qū)Σ《狙蹇贵w進(jìn)行定性、定量檢測的一項(xiàng)新型體外診斷技 術(shù)，這種技術(shù)突破性地將病毒抗原點(diǎn)布在具有極強(qiáng)蛋白吸附力的硝酸纖維膜上，把包被好 的抗原膜貼附于PVC板以增加膜的強(qiáng)度和硬度，經(jīng)機(jī)器裁切制成免疫梳。將此免疫梳插入稀 釋好的待檢血清樣本時(shí)，特異性抗體與抗原結(jié)合并固著于膜上，再通過酶標(biāo)二抗底物反應(yīng)， 染色后，抗體陽性的樣本表現(xiàn)為肉眼可見的紅色斑點(diǎn)，陰性則無顏色變化。膜經(jīng)過圖像處理 系統(tǒng)數(shù)據(jù)化后可以進(jìn)行定量分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服當(dāng)前技術(shù)在推廣使用中存在的缺陷，提供一種猴MeV病 毒抗體快速檢測免疫梳的制備方法。
[0005] 本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 1、一種用于構(gòu)建猴Me V病毒抗體的免疫梳的S0E-PCR引物組，引物Me VF:如序列表Se q No. 1所示，引物MeVRl:如序列表Seq No. 2所示，引物MeVR2:如序列表Seq No. 3所示。
[0006] 2、一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達(dá)載體pGEX-4T-MeV，序列如序 列表Seq No.4所示。
[0007] 3、一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達(dá)載體pGEX-4T-MeV的構(gòu)建方 法，包括如下步驟： (1) 根據(jù)猴MeV病毒的基因序列，設(shè)計(jì)S0E-PCR擴(kuò)增引物，引物MeVF:如序列表Seq No. 1 所示，引物MeVRl:如序列表Seq No.2所示，引物MeVR2:如序列表Seq No.3所示； (2) 進(jìn)行S0E-PCR擴(kuò)增猴MeV病毒基因； (3) 猴MeV病毒基因的回收； (4) 克隆質(zhì)粒pMD18T-MeV的構(gòu)建及測序； (5) 表達(dá)載體pGEX-4T_MeV的構(gòu)建，序列如序列表Seq No. 4所示。
[0008] 4、如上所述的一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達(dá)載體PGEX-4T-MeV的構(gòu)建方法，所述的步驟(2 )采用S0E-PCR反應(yīng)的具體步驟如下： 第一輪PCR反應(yīng)條件： 將混合液在95 °C預(yù)變性5 min，94 °C變性1 min，60 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，15 個(gè)循環(huán)，72 °C總延伸10 min; 上述混合液如下所示：
第二輪PCR反應(yīng)條件： 將混合液在95 °C預(yù)變性5 min，94 °C變性1 min，63 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 °C總延伸10 min; 上述混合液如下所示:_|_
5、如上所述的一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達(dá)載體pGEX-4T-MeV的 構(gòu)建方法，所述的步驟(5 )pGEX-4T-MeV的構(gòu)建方法具體步驟如下:利用EcoRI與Xho I分別將 pMD18T-MeV和pGEX-4T-l進(jìn)行雙酶切，并膠回收酶切的目的片段，將回收的目的片段進(jìn)行連 接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選陽性菌落， 并提取質(zhì)粒進(jìn)行P vu I酶切鑒定，將鑒定陽性的質(zhì)粒命名為pGEX-4T-Me V。
[0009] 6、一種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙的制備方法，包括如下步驟： (1) 以重組表達(dá)載體pGEX-4T-MeV表達(dá)猴MeV病毒蛋白； (2) 猴MeV蛋白的純化與定量； (3 )免疫梳檢測試紙的制備： (3.1) 將步驟(1)中表達(dá)的猴MeV病毒蛋白以0.1 mg/mL的濃度進(jìn)行線性包被NC膜，將膜 晾干； (3.2) 用0.05g/mL的BSA封閉液封閉NC膜過夜，棄去封閉液后再次晾干； (3.3) 將包被好的NC膜裁剪成標(biāo)準(zhǔn)尺寸的試紙條，依次按一定間距整齊固定于PVC板 上，十二條為一組或直接裁剪包被好的NC膜制成免疫梳檢測試紙，最終于自封袋中低溫保 存?zhèn)溆谩?br>[0010] 7、如上所述的一種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙的制備方法制備的一種猴 MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙。
[0011] 8、如上所述的一種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙，其檢測方法如下： (1) 將1:25倍稀釋的待檢血清樣品轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)反應(yīng)板中，標(biāo)記順序號； (2) 將免疫梳檢測齒依次伸入各反應(yīng)孔內(nèi)的血清液面之下，37 °C輕輕震蕩30-60 min； (3) 取出免疫梳用TBS-T緩沖液沖洗三次，每次3-5 min，同時(shí)將稀釋好的堿性磷酸酶標(biāo) 記1:500兔抗猴二抗溶液順次加入另一排酶標(biāo)反應(yīng)板孔中，每孔2 300 yL，將洗過的免疫梳 依次伸入各反應(yīng)孔中，37 °C震蕩30-60 min; (4) 取出免疫梳按上述方法沖洗3次后置于干凈的方盒中加入顯色液，靜止、閉光顯色 1-15 min，最后用蒸餾水沖洗免疫梳并觀察記錄反應(yīng)結(jié)果； (5) 上述操作過程中設(shè)立陽性對照與陰性對照各1孔； (6) 陽性對照免疫梳齒上有明顯的肉眼可見反應(yīng)條帶，藍(lán)紫或黑色，且陰性對照梳齒上 無反應(yīng)條帶，說明檢測有效，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行下一步待測樣品的判定； (7) 待測樣品檢測的免疫梳齒上與陽性對照梳齒上相同位置處出現(xiàn)可見反應(yīng)條帶的判 定為陽性檢測結(jié)果，若待測樣品檢測的免疫梳齒上無反應(yīng)條帶出現(xiàn)則判定為陰性檢測結(jié) 果。
[0012] 9、如上所述的一種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙?jiān)跈z測猴MeV病毒抗體中的 應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供了一種不需要特定儀器設(shè)備輔助的檢測試劑，解決了目前進(jìn)出口實(shí)驗(yàn) 猴MeV病毒抗體檢測缺乏現(xiàn)場操作簡便的試劑盒的現(xiàn)狀，提供了一種能夠應(yīng)用于大規(guī)?，F(xiàn) 地檢樣的檢測方法。該方法具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、不需任何特殊儀器，保留了常規(guī)ELISA的 敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)，又克服了許多繁瑣的操作，節(jié)省了操作時(shí)間，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，完全可在 野外進(jìn)行實(shí)地診斷檢測，達(dá)到快速診斷的目的，能夠滿足口岸機(jī)場、碼頭的快速通關(guān)檢測， 在基層具有良好的運(yùn)用推廣前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為猴MeV病毒抗原表位基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖， 其中，M:DNA Marker 2000; 1:水對照;2:猴MeV病毒抗原表位編碼基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0015] 圖2為猴MeV病毒抗原表位基因重組表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果圖， 其中，M:DNA Marker DS 5000 Ladder;l:PvuI酶切切質(zhì)粒pGEX-4T-MeV;2:質(zhì)粒pGEX-4T-MeV〇
[0016] 圖3為猴MeV病毒表位抗原蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果圖， 其中，1 -3:空載體菌誘導(dǎo)對照;Μ:蛋白Mar ker (kDa )位置;4:誘導(dǎo)的pGEX-4T-Me V。
[0017] 圖4為猴MeV病毒表位抗原蛋白的純化結(jié)果圖， 其中，M:蛋白分子量Marker位置；1:切膠純化后的猴MeV病毒的重組表達(dá)蛋白MeV32。
[0018] 圖5為重組猴MeV病毒的重組表達(dá)蛋白MeV32蛋白抗原最佳包被量確定圖， 其中，1_7分別代表MeV32包被濃度即，lmg/mL、0 · lmg/mL、0 · 01mg/mL、lyg/mL、100ng/ mL、1Ong/mL和1ng/mL 〇
[0019] 圖6為Western-blot分析重組猴MeV病毒的重組表達(dá)蛋白MeV32蛋白抗原特異性 結(jié)果圖，其中，1-5分別代表MeV32抗原與猴MeV病毒陽性血清猴、SIV病毒陽性血清、猴SRV1 病毒陽性血清、猴B病毒陽性血清以及STLV1病毒陽性血清猴免疫反應(yīng)結(jié)果。
[0020] 圖7為重組猴MeV病毒的重組表達(dá)蛋白MeV32蛋白抗原敏感性分析結(jié)果圖， 其中，1-6 分別代表 MeV30 抗原與 1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800倍稀釋的猴 MeV 病毒陽性血清反應(yīng)結(jié)果。
[0021] 圖8為免疫梳制作流程圖。
[0022] 圖9為代表猴MeV病毒抗體免疫梳的特異性檢測結(jié)果， 其中，"+"代表1:50猴MeV病毒陽性血清抗體對照，