齒上無反應條帶，說 明檢測有效，在此基礎上進行下一步待測樣品的判定；（2)待測樣品檢測的免疫梳齒上與陽 性對照梳齒上相同位置處出現(xiàn)可見反應條帶的判定為陽性檢測結果，若待測樣品檢測的免 疫梳齒上無反應條帶出現(xiàn)則判定為陰性檢測結果。
[0040] 實施例11猴MeV病毒血清抗體免疫梳檢測的特異性與敏感性分析 先將10倍樣品稀釋液用去離子水稀釋至1倍工作濃度，然后放于EP管中，依次分別以1: 50稀釋陽性、陰性以及待檢血清至EP管中各0.5 mL作為一抗，室溫放置備用。將陽性對照 和陰性對照血清進行1:50倍稀釋各0.5 mL，再將猴MeV病毒陽性血清1:25-1:6400倍稀釋用 于敏感性檢驗；將其它猴病毒(SRV1、SIV、STLV1和MeV)陽性血清稀釋1:25倍和1:50倍用作 特異性檢驗;然后將各稀釋血清樣品依次轉移至96孔酶標反應板中（2 300 μ!7孔），標記順 序號。取免疫梳依次插入各反應孔內(nèi)的血清液面之下，以37 °C條件下輕輕震蕩作用30-60 min。取出免疫梳用TBS-T緩沖液沖洗免疫梳三次、每次3-5 min，然后放置于吸水紙上吸干。 用樣品稀釋液將堿性磷酸酶標記兔抗猴二抗（1:500)稀釋，并順次加入另一排酶標反應板 孔中（2 300 yL /孔），將免疫梳依次伸入各反應孔中、37 °C條件下輕輕震蕩作用30-60 min。取出免疫梳按上述方法沖洗5次，然后放置于吸水紙上吸干。將BCIP/NBT顯色片劑一片 溶于30 mL去離子水中溶解后。取10 mL顯色液加入一干凈方盒中，然后將免疫梳浸于顯色 液中，靜止、閉光顯色1-15 min，最后用蒸餾水沖洗終止顯色，并觀察記錄免疫梳上反應結 果。
[0041 ]特異性檢驗結果如圖9所示，猴MeV病毒抗體免疫梳均能夠特異性檢測到猴MeV病 毒的陽性血清而不與其它病毒陽性血清間發(fā)生交叉反應，由此說明設計制備的猴MeV病毒 免疫梳特異性良好。
[0042]敏感性檢驗結果如圖10所示，猴MeV病毒抗體免疫梳的最大血清陽性檢測稀釋度 為1:100,說明設計制備的猴MeV病毒免疫梳敏感性良好達到了預期。
[0043]實施例12免疫梳的重復性與穩(wěn)定性檢測 (1)免疫梳的重復性檢測 在同一批試驗中每份樣品平行作3次(批內(nèi)），在3個不同試驗日重復測定6份樣品（批 間）。分別統(tǒng)計分析批內(nèi)和批間重復試驗變異系數(shù)情況。結果顯示，批內(nèi)重復試驗變異系數(shù) (CV)小于7 %，批間重復試驗CV小于10 %。說明免疫的重復性良好。
[0044] (2)免疫梳的穩(wěn)定性檢測 將同一批次3條4 °C保存，分別在1、3和6個月的間隔與新制備的免疫梳同時對猴MeV病 毒的陰、陽性血清進行檢測，統(tǒng)計分析免疫梳的特異性與敏感性沒有明顯變化，并再次對同 一份樣品平行作3次進行比較分析其穩(wěn)定性。結果顯示，免疫梳的特異性與敏感性沒有明顯 變化，對同一份樣品平行作3次進行比較，CV均小于10 %。說明免疫梳的穩(wěn)定性良好。
【主權項】
1. 一種用于構建猴MeV病毒抗體的免疫梳的SOE-PCR引物組，其特征在于，引物MeVF:如 序列表Seq No.1所示，引物MeVRl:如序列表Seq No.2所示，引物MeVR2:如序列表Seq No.3 所示。2. -種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-MeV，其特征在于， 序列如序列表Seq No.4所示。3. -種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-MeV的構建方法，其 特征在于，包括如下步驟： (1) 根據(jù)猴MeV病毒的基因序列，設計SOE-PCR擴增引物，引物MeVF:如序列表Seq No. 1 所示，引物MeVRl:如序列表Seq No.2所示，引物MeVR2:如序列表Seq No.3所示； (2) 進行SOE-PCR擴增猴MeV病毒基因； (3) 猴MeV病毒基因的回收； (4) 克隆質(zhì)粒pMDlST-MeV的構建及測序； (5 )表達載體pGEX-4T-MeV的構建，序列如序列表Seq No. 4所示。4. 根據(jù)權利要求3所述的一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-MeV的構建方法，其特征在于，所述的步驟(2)采用SOE-PCR反應的具體步驟如下： 第一輪PCR反應條件： 將混合液在95 °C預變性5 min,94 °C變性1 min,60 °C退火30 S，72 °C延伸1 min, 15 個循環(huán)，72 °C總延伸10 min; 上述混合液如下所示：第二輪PCR反應條件： 將混合液在95 °C預變性5 min,94 °C變性1 min,63 °C退火30 S，72 °C延伸1 min,30 個循環(huán)，72 °C總延伸10 min; 上述混合液如下所示：5. 根據(jù)權利要求3所述的一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-MeV的構建方法，其特征在于，所述的步驟巧)pGEX-4T-MeV的構建方法具體步驟如下:利 用EcoRI與化〇1分別將pMDlST-MeV和PGEX-4T-1進行雙酶切，并膠回收酶切的目的片段，將 回收的目的片段進行連接，將連接產(chǎn)物轉化到化21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞中，利用氨節(jié)青 霉素抗性篩選陽性菌落，并提取質(zhì)粒進行PvuI酶切鑒定，將鑒定陽性的質(zhì)粒命名為pGEX- 4T-MeV。6. -種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) W重組表達載體pGEX-4T-MeV表達猴MeV病毒蛋白； (2 )猴MeV蛋白的純化與定量； (3 )免疫梳檢測試紙的制備： (3.1) 將步驟（1)中表達的猴MeV病毒蛋白Wo. 1 mg/mL的濃度進行線性包被NC膜，將膜 驚干； (3.2) 用0.05g/mL的BSA封閉液封閉NC膜過夜，棄去封閉液后再次驚干； (3.3) 將包被好的NC膜裁剪成標準尺寸的試紙條，依次按一定間距整齊固定于PVC板 上，十二條為一組或直接裁剪包被好的NC膜制成免疫梳檢測試紙，最終于自封袋中低溫保 存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權利要求6所述的一種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙的制備方法制備的一 種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙。8. 根據(jù)權利要求7所述的一種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙，其特征在于，其檢測 方法如下： (1) 將1:25倍稀釋的待檢血清樣品轉移至96孔酶標反應板中，標記順序號； (2) 將免疫梳檢測齒依次伸入各反應孔內(nèi)的血清液面之下，37 °C輕輕震蕩30-60 min; (3) 取出免疫梳用TBS-T緩沖液沖洗S次，每次3-5 min,同時將稀釋好的堿性憐酸酶標 記1:500兔抗猴二抗溶液順次加入另一排酶標反應板孔中，每孔含300 yL，將洗過的免疫梳 依次伸入各反應孔中，37 °C震蕩30-60 min; (4) 取出免疫梳按上述方法沖洗3次后置于干凈的方盒中加入顯色液，靜止、閉光顯色 1-15 min,最后用蒸饋水沖洗免疫梳并觀察記錄反應結果； 巧)上述操作過程中設立陽性對照與陰性對照各巧L; (6) 陽性對照免疫梳齒上有明顯的肉眼可見反應條帶，藍紫或黑色，且陰性對照梳齒上 無反應條帶，說明檢測有效，在此基礎上進行下一步待測樣品的判定； (7) 待測樣品檢測的免疫梳齒上與陽性對照梳齒上相同位置處出現(xiàn)可見反應條帶的判 定為陽性檢測結果，若待測樣品檢測的免疫梳齒上無反應條帶出現(xiàn)則判定為陰性檢測結 果。9. 根據(jù)權利要求7所述的一種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙在檢測猴MeV病毒抗體 中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明主要涉及到一種猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。用于制建免疫梳的重組質(zhì)粒pGEX-4T-？MeV，如序列表Seq？No.4所示。用于構建重組質(zhì)粒的引物對，上引物MeVF：如序列表Seq？No.1所示；下引物MeVR1：如序列表Seq？No.2所示；下引物MeVR2：如序列表Seq？No.3所示。構建方法，包括如下步驟：根據(jù)猴MeV病毒的核苷酸序列設計SOE-PCR引物對；進行SOE-PCR擴增猴MeV基因；構建重組質(zhì)粒pGEX-4T-？MeV。最后利用酶聯(lián)免疫原理和膜層析技術制成快速檢測實驗猴血液或血清中的抗體的免疫梳。免疫梳具有良好的穩(wěn)定性、特異性、敏感性及重復性。
【IPC分類】C12N15/11, G01N33/52, G01N33/68, C12N15/66, C12N15/70, G01N33/569
【公開號】CN105647916
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李丹丹, 徐義剛, 高慎陽, 王昱
【申請人】海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月17日