甲胎蛋白核酸適體afp1及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于球蛋白檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸，特別是涉及高特異性和高親和力的甲胎蛋白核酸適體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甲胎蛋白(AFP)是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來(lái)自胚胎的肝細(xì)胞，胎兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。甲胎蛋白在產(chǎn)婦羊水或母體血漿中AFP可用于胎兒產(chǎn)前監(jiān)測(cè)。如在神經(jīng)管缺損、脊柱裂、無(wú)腦兒等時(shí)，AFP可由開(kāi)放的神經(jīng)管進(jìn)入羊水而導(dǎo)致其在羊水中含量顯著升高。胎兒在宮腔內(nèi)死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可經(jīng)羊水部分進(jìn)入母體血循環(huán)。在85%脊柱裂及無(wú)腦兒的母體，血漿AFP在妊娠16-18周可見(jiàn)升高而有診斷價(jià)值，但必須與臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性的錯(cuò)誤。
[0003]檢測(cè)甲胎蛋白的方法有好幾種，放射免疫法測(cè)得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500微克/升、且持續(xù)4周者，或甲胎蛋白在200?500微克/升、持續(xù)8周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌癥后，需再結(jié)合定位檢查，如B超、CT、磁共振(MRI)和肝血管造影等即可作出診斷。不過(guò)，正常懷孕的婦女、少數(shù)肝炎和肝硬化、生殖腺惡性腫瘤等情況下甲胎蛋白也會(huì)升高，但升高的幅度不如肝癌那樣高。肝硬化病人血清甲胎蛋白濃度多在25?200微克/升之間，一般在2個(gè)月內(nèi)隨病情的好轉(zhuǎn)而下降，多數(shù)不會(huì)超過(guò)2個(gè)月；同時(shí)伴有轉(zhuǎn)氨酶升高，當(dāng)轉(zhuǎn)氨酶下降后甲胎蛋白也隨之下降，血清甲胎蛋白濃度常與轉(zhuǎn)氨酶呈平行關(guān)系。如果甲胎蛋白濃度在500微克/升以上，雖有轉(zhuǎn)氨酶升高，但肝癌的可能性大，轉(zhuǎn)氨酶下降或穩(wěn)定，而甲胎蛋白上升，也應(yīng)高度懷疑肝癌。目前甲胎蛋白的檢測(cè)方法有三大類:色譜法、免疫學(xué)法、循環(huán)酶法。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標(biāo)準(zhǔn)化;而且HPLC設(shè)備價(jià)格昂貴、技術(shù)條件要求高，需專門的維護(hù)人員，使其推廣困難。免疫學(xué)法需要還原游離AFP形式，抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測(cè)游離型同型半胱胺酸，只能檢測(cè)血漿總同型半胱胺酸，用還原劑在37°C半小時(shí)卵育對(duì)血樣進(jìn)行還原處理。免疫學(xué)法需一小時(shí)以上才能出結(jié)果，操作步驟繁瑣，因?yàn)樾枰M(jìn)行還原處理可受一些不確定的因素影響。循環(huán)酶法過(guò)程繁瑣，且檢測(cè)限低、產(chǎn)生誤差較大，價(jià)格昂貴，故得不到推廣。
[0004]核酸適配體是近年發(fā)展起來(lái)的一類新型識(shí)別分子，近年來(lái)受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，大量針對(duì)重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來(lái);各種基于核酸適配體的分析方法和技術(shù)已被報(bào)道;核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準(zhǔn)上市。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子，國(guó)內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識(shí)體或核酸適配體等。SELEX技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列組成)文庫(kù)，通過(guò)施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過(guò)程)，并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù)，經(jīng)過(guò)多輪的循環(huán)選擇富集，獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子，可以是RNA也可以是DNA，長(zhǎng)度一般為25?60個(gè)核苷酸。
[0005]由上可知，核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性，使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景，盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少，但應(yīng)用適體檢測(cè)球蛋白的研究卻不斷增多，基于適體的檢測(cè)新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。但是目前基于核酸適體的針對(duì)于甲胎蛋白的高效特異性識(shí)別研究還很缺乏，且針對(duì)于甲胎蛋白的核酸適體及其篩選制備方法尚未見(jiàn)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的甲胎蛋白檢測(cè)技術(shù)的不足，填補(bǔ)還未見(jiàn)甲胎蛋白的核酸適體及其篩選制備方法空白，提供一種甲胎蛋白核酸適體及其制備方法，本發(fā)明所提供的核酸適體命名AFPl。
[0007]本發(fā)明的方案是通過(guò)這樣實(shí)現(xiàn)的:一種甲胎蛋白核酸適體，其特征在于，所述核酸適體的核苷酸序列其序列為:ggcatgggag gtgtaatggc cgagcgattc tactaggacatcgatgacc agtctgcgo
[0008]以上所述甲胎蛋白核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種:
(1)將權(quán)利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；
(2)權(quán)利要求1中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；
(3)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的肽核酸；
(4)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的鎖核酸。
[0009]—種以上所述甲胎蛋白核酸適體或其衍生物在識(shí)別、檢測(cè)甲胎蛋白，或者制備檢測(cè)甲胎蛋白的試劑盒方面的應(yīng)用。
[0010]為了使本發(fā)明公開(kāi)充分，本發(fā)明甲胎蛋白核酸適體的制備方法步驟如下:
甲胎蛋白核酸適體的制備方法包括以下步驟:
I)合成單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫(kù):所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)的兩端為固定序列，作為PCR擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)，中間為60個(gè)堿基的隨機(jī)序列，庫(kù)容量115以上。所述PCR引物為:
引物 1:5 ’ -ATACCAGCTTATTCAATT-3 ’
引物2:5 ’ -B1tin-AGATTGCACTTACTATCT-3 ’
所述PCR引物2帶有5，端生物素標(biāo)記。
[0011]2)制備連接甲胎蛋白的固相基質(zhì):以微磁珠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法把甲胎蛋白通過(guò)其羧基共價(jià)連接到微磁珠上。
[0012]3)初次篩選目的寡核苷酸序列:將DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)與甲胎蛋白混合，篩選除去DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中不結(jié)合和非特異結(jié)合甲胎蛋白的寡核苷酸序列，回收特異結(jié)合甲胎蛋白的核酸序列。
[0013]4)制備次級(jí)單鏈DNA寡核苷酸庫(kù):將步驟3中所得與甲胎蛋白特異結(jié)合的寡核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)堿變性解鏈，過(guò)濾，純化，獲得次級(jí)DNA寡核苷酸庫(kù)，用于下一輪篩選。
[0014]5)篩選并鑒定甲胎蛋白核酸適體:將步驟4所得的次級(jí)單鏈DNA寡核苷酸庫(kù)進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過(guò)15輪篩選后獲得目標(biāo)寡核酸序列。克隆并測(cè)序所述目標(biāo)寡核酸序列，通過(guò)酶聯(lián)核酸適體吸附測(cè)定法鑒定其與甲胎蛋白結(jié)合的特異性和親和力。
[0015]6)所述甲胎蛋白核酸適體可作為檢測(cè)試劑用于檢測(cè)甲胎蛋白。
[0016]本發(fā)明的有益效果如下:(I)所篩選到的核酸適體分子量小，無(wú)毒性，有利于分子探針的設(shè)計(jì)，易于合成與標(biāo)記；(2)核酸適體只特異的識(shí)別甲胎蛋白