，不結(jié)合非甲胎蛋白和其它球蛋白分子，結(jié)合甲胎蛋白的能力是結(jié)合非甲胎蛋白Hb的能力的20?80倍，可以成為鑒別甲胎蛋白的試劑，提高檢測(cè)方法的特異性和靈敏度，簡(jiǎn)化檢測(cè)方法，降低成本。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為本發(fā)明核酸適體與甲胎蛋白的結(jié)合能力，圖1中橫坐標(biāo)為核酸適體DNA濃度，縱坐標(biāo)為解離常數(shù)(Kd)相對(duì)值，圖中AFP曲線表示核酸適體AFPI與甲胎蛋白的結(jié)合曲線，Ap曲線表示核酸適體AFPl與非甲胎蛋白的結(jié)合曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施I甲胎蛋白特異結(jié)合的核酸適體AFPl的制備
構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫(kù):人工合成單鏈DNA序列，構(gòu)建庫(kù)容量為I X 15的單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫(kù)，單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)包括的DNA序列為:
5 ’ -GGATCCACCAGCGTCATCAGCA-N25~4o-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)的DNA序列包括中間隨機(jī)序列N25~6Q和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列N25~4o為30?40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為:5’_GGATCCACCAGCGTCATCAGCA，3 ’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述兩端固定序列為 PCR 擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)
I)將0.5ml (IxlO9微粒)Invitrogen公司的帶有活化氨基的微磁珠與I mo I/L甲胎蛋白在偶聯(lián)緩沖液(20mM磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl, ImM DTT，pH 5.5)中混合，加入200ul偶聯(lián)劑溶液[57% 1-ethyl-3- (3-dimethyIaminopropyI) carbodiimide (EDC)],將上述反應(yīng)置于25 °C條件下輕混24小時(shí)。將藕連甲胎蛋白的磁珠用磁珠分離裝置和清洗液(PBS，ImM DTT，批H7.3)清洗后，重新懸浮于0.5ml PBS中。
[0019]2)將5nmol單鏈DNA文庫(kù)溶于結(jié)合緩沖液(100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH7.6, 2 mM MgC12, 5mM KCl，I mM CaCl2,0.02% Tween 20, I mM DTT)，進(jìn)行加熱處理:90 °C加熱1min，置于冰上1min，然后溫度放置5min。
[0020]3)將處理好的單鏈DNA文庫(kù)與結(jié)合有球蛋白的微磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的液體。
[0021]4)將步驟3)收集的液體與25ul步驟I)得到的甲胎蛋白-磁珠一起在結(jié)合緩沖液中37。(:溫育3011^11。
[0022]5)用結(jié)合緩沖液洗滌溫育后的磁珠，然后加入200ul洗脫緩沖液(20 mM Tris-HClPH7.6, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA)，92°C孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0023]6)PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5 min; 940C 30s，470C Imin，720C Imin，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán);最終延伸反應(yīng)為72 °C lOmin。
[0024]7)PCR產(chǎn)物為5’端帶有生物素標(biāo)記的雙鏈DNA，將產(chǎn)物與鏈霉親和素磁珠混合，25°C孵育30min后，用0.15 mol/L NaOH使雙鏈DNA變性為單鏈DNA，通過(guò)脫鹽柱純化即得到下一輪篩選的單鏈DNA文庫(kù)。
[0025]8)使用200pmol步驟7)得到的新單鏈DNA文庫(kù)，重復(fù)進(jìn)行步驟2)至步驟8)的篩選程序，共進(jìn)行15輪篩選。最后克隆并測(cè)序第15輪單鏈DNA文庫(kù)，得到AFPl核酸序列:ggcatgggaggtgtaatggc cgagcgattc tactaggaca tcgatgacc agtctgcg。
[0026]實(shí)施例2以流式分析法檢測(cè)核酸適體AFPl與甲胎蛋白的結(jié)合能力 I)合成5，端帶熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記的甲胎蛋白核酸適體。
[0027]2)使用O nml/L, 5 nml/L, 10 nml/L, 20 nml/L, 50 nml/L, 100 nml/L, 200nml/L濃度梯度的FAM標(biāo)記的核酸適體連接甲胎蛋白(AFP)的微磁珠來(lái)測(cè)定甲胎蛋白核酸適體的解離常數(shù)(kd)。用200yL結(jié)合緩沖液稀釋的上述各種濃度核酸適體，加入150 nmol/L連接甲胎蛋白的微磁珠，37 °C溫育30min。用結(jié)合緩沖液洗滌磁珠后，重新懸浮在250yL結(jié)合緩沖液中。設(shè)置隨機(jī)序列的寡核苷酸片段和連接球蛋白(Ap)的微磁珠作為對(duì)照。
[0028]3)使用BD公司的流式細(xì)胞儀對(duì)微珠進(jìn)行熒光測(cè)定，然后用Sigma plot軟件作圖，計(jì)算出所篩選到的核酸適體與甲胎蛋白相互作用的解離常數(shù)(kd)相對(duì)值，結(jié)果如圖1所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種甲胎蛋白核酸適體，其特征在于，所述核酸適體的核苷酸序列其序列為: ggcatgggag gtgtaatggc cgagcgattc tactaggaca tcgatgacc agtctgcgo2.—種權(quán)利要求1中任一所述甲胎蛋白核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種: (1)將權(quán)利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物； (2)權(quán)利要求1中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的肽核酸； (4)權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的鎖核酸。3.—種權(quán)利要求1或2中所述甲胎蛋白核酸適體或其衍生物在識(shí)別、檢測(cè)甲胎蛋白，或者制備檢測(cè)甲胎蛋白的試劑盒方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)具有高特異性和高親和力的甲胎蛋白核酸適體及其制備方法。甲胎蛋白核酸適體的核苷酸序列為：ggcatgggag？gtgtaatggc？cgagcgattc？tactaggaca？tcgatgacc？agtctgcg，命名為AFP1。甲胎蛋白核酸適體制備方法包括：構(gòu)建隨機(jī)序列文庫(kù)，篩選靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，分離目的寡核苷酸適體，PCR擴(kuò)增目的寡核苷酸適體，循環(huán)篩選出高度特異性適體，甲胎蛋白核酸適體的修飾。制備獲得的核酸適體無(wú)毒性，分子量小，易于合成與標(biāo)記，只特異性識(shí)別甲胎蛋白，對(duì)其他異型球蛋白或其類似物不識(shí)別結(jié)合，可成為檢測(cè)甲胎蛋白含量的分子信標(biāo)。
【IPC分類】G01N33/68, C12N15/115
【公開(kāi)號(hào)】CN105647932
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】徐大鵬
【申請(qǐng)人】徐大鵬
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年3月25日...