c γ Rma-ΒΒ-ζ-NK細胞凍存前和凍存后的細胞活率比較圖。 [0068]圖10是本發(fā)明制備的Fc yRIIIa-ΒΒ-ζ-ΝΚ細胞凍存前和凍存復(fù)蘇后的細胞殺傷能 力比較圖。
[0069] 下面對本發(fā)明進一步詳細說明。但下述的實例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代 表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護范圍，本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。
【具體實施方式】
[0070] 下面結(jié)合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0071] 為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的 實施例如下：
[0072] 圖1示出了本發(fā)明嵌合基因的結(jié)構(gòu)，該FcyRHIa-CAR分子結(jié)構(gòu)具體為：
[0073] Kozak-Fc γ Rma信號肽-Fc γ Rma細胞外區(qū)域-CD8a跨膜區(qū)域-4-1ΒΒ-〇)3ζ
[0074] 本發(fā)明中的嵌合基因不含有⑶8α鉸合區(qū)，其是采用Fey Rma細胞外區(qū)域直接與 ⑶8α跨膜區(qū)域連接而成。
[0075] 實施例1Fe γ Rma-ΒΒ-ζ慢病毒表達載體的限制性內(nèi)切酶BamH/Sall雙酶切鑒定
[0076] 圖2是嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ在慢病毒表達載體pLVX-EFla載體上用BamHl和 Sail雙酶切后釋放的目的基因部分，目的基因片段1269bp。泳道1為核酸分子量標準，泳道2 為BamHl和Sail雙酶切產(chǎn)物。
[0077]將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司對插入的嵌合基因片段 進行測序。將測序測序正確的質(zhì)粒命名為pLVX-Fc γ Rma-ΒΒ-ζ。
[0078] 實施例2Fc γ Rma-ΒΒ-ζ慢病毒的制備
[0079] Fc γ Rma-ΒΒ-ζ嵌合基因如本發(fā)明所述進行設(shè)計和構(gòu)造。嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ 的慢病毒制備和純化采用如下所述方法：
[0080] 1 ·米用Qiagen EndoFree Plasmid Maxi Kit抽提質(zhì)粒；
[0081 ] 2.預(yù)先準備100mm培養(yǎng)皿的293T細胞；
[0082] 3.將細胞用胰酶消化后，用電動移液器吸取10ml完全培養(yǎng)基，將所有細胞吹打成 單細胞懸液，按比例轉(zhuǎn)到其他100mm培養(yǎng)皿中；37°C，5%C02培養(yǎng)箱過夜；
[0083] 4.細胞融合度在70 %-80 %時轉(zhuǎn)染；
[0084] 5.細胞換液，全量替換為新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基；
[0085] 6.配制質(zhì)?；旌弦?取一個新的1.5ml離心管，加入0.5mL DMEM和質(zhì)粒；
[0086] 7.配制ΡΕΓ混合液:取一個新的1.5ml離心管，加入0.5mL DMEM和30μ1 PEI，混勻；
[0087] 8.將PEI混合液加到質(zhì)?；旌弦褐校靹?，室溫靜置15min;
[0088] 9.取一皿細胞，將離心管中的1ml混合液滴加進去，盡可能使轉(zhuǎn)試劑分布到整個培 養(yǎng)皿中；
[0089] 10.將培養(yǎng)皿放還到5 % C02培養(yǎng)箱中，放置6h;
[0090] 11.轉(zhuǎn)染6h后換液，換成10ml完全培養(yǎng)基；
[0091 ] 12.轉(zhuǎn)染48h后，將同一個病毒包裝上清液收集到一起，丟棄培養(yǎng)皿；
[0092] 13.分裝到50ml離心管中，500g室溫離心10min，除去細胞和大的碎片；
[0093] 14.用0.22μΜ針式濾頭過濾上清液，置于4°C，待純化；
[0094] 15.使用AKTA flux 6機器，5L病毒0.65μπι中空纖維微濾柱過柱；
[0095] 16.使用AKTA flux 6機器，病毒300kD中空纖維超濾柱過柱；
[0096] 17.病毒濃縮至200ml;
[0097] 18.使用AKTA pure 150Protein Purification System進行病毒純化；
[0098] 19.病毒用50ml PBS洗脫；
[0099] 20.病毒用0.22μΜ的濾頭過濾，病毒管分裝。
[0100] 慢病毒包被體系包括但不限于三質(zhì)粒表達系統(tǒng)和四質(zhì)粒表達系統(tǒng)，本實施例中優(yōu) 選四質(zhì)粒表達系統(tǒng)（目的質(zhì)粒、pRRE、pREV、VSVG)。
[0101] 慢病毒純化體系包括但不限于超速離心法、透析法、超濾法等，本發(fā)明優(yōu)選中空纖 維超濾法。
[0102] 實施例3嵌合Fc yRina-BB-G基因的細胞產(chǎn)物的制備
[0103] 細胞來源于患者或者健康供者，采用靜脈采血方式或者血液成分單采術(shù)獲得外周 血單個核細胞(PBMChT細胞培養(yǎng)方法采用⑶3、⑶28單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶活化T細胞方 法，或者采用包被有CD3和CD28單克隆抗體的順磁聚丙乙烯珠 T細胞活化方法，NK細胞培養(yǎng) 方法如所述進行(Hiroyuki等，Cancer Res 2009; 69:4010-4017)。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)如文所述操 作（Levine等，2006，Proc Natl Acad Sci USA103:17372-17377)。
[0104] 實施例4流式細胞術(shù)檢測嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ修飾的T細胞表型鑒定
[0105] 采用實施例3的方法培養(yǎng)Τ細胞至第14天，Western Blotting檢測嵌合Fc γ RHIa- ΒΒ-ζ基因的T細胞中內(nèi)源性⑶3和融合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ的表達。如圖3所示。
[0106] 圖3示出了轉(zhuǎn)染融合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ慢病毒的Τ細胞，用Western Blotting檢 測內(nèi)源性CD3和融合蛋白的表達。泳道1為未轉(zhuǎn)染的T細胞作為陰性對照，泳道2為5M0I慢病 毒轉(zhuǎn)染的T細胞，泳道3為10M0I慢病毒轉(zhuǎn)染的T細胞，內(nèi)參為β-actin。結(jié)果顯示成功表達融 合蛋白。
[0107] 實施例5病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測
[0108] 10M0I融合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ慢病毒感染T細胞5天，取樣做流式細胞儀檢測 ⑶3PE、⑶16FITC表達，⑶16表達量表示慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
[0109] 如圖4-A和4-B所述，CD16的表達量為83.57%，即融合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ慢病毒 的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為83.57%。
[0110] 實施例6流式細胞術(shù)檢測⑶3ζ的磷酸化水平
[0111] 采用同一供者來源的PBMC，10M0I融合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ慢病毒感染Τ細胞，培養(yǎng) 至第5天。對照組采用10M0I融合基因 Fc γ Rma-⑶8α-ΒΒ-ζ慢病毒感染T細胞，培養(yǎng)至第5天。 取CD20陽性的Raji細胞1 X 105,加入lμg/ml的Rituximab抗體，與轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)到第5天的Τ細 胞1 X 106共孵育2小時。流式細胞術(shù)檢測CD3G的磷酸化水平。結(jié)果如圖5所示。
[0112] 如圖5-A所示，F(xiàn)c γ RIIIa-CD8a-BB-G磷酸化水平為50 · 45 %，如圖5-B所述，F(xiàn)c γ Rm a-ΒΒ-ζ磷酸化水平為79.77%，兩者有明顯差異。說明本發(fā)明所設(shè)計的CAR分子結(jié)構(gòu)Fey Rm a-ΒΒ-ζ較已有技術(shù)Fc γ RIIIa-CD8a-BB-G更有利于0)3ζ的磷酸化，有利于轉(zhuǎn)染的T細胞的活 化，預(yù)示著對腫瘤細胞更高的殺傷能力。
[0113] 實施例7細胞殺傷試驗
[0114] 抗體孵育的濃度為 0 · lμg/ml，Ε:Τ = 5:1、2.5:1、1.25:1、0.6:1、0.3:1，5 種靶效比 情況下對Raji細胞（CD20+，rituximab)、SK0V3細胞（Her2+，trastuzumab)、ΑΝΤ1細胞（CCR4 +，mogamulizumab)的殺傷能力分析。
[0115] 結(jié)果如圖6-A、圖6-B和圖6-C所示，在不同的效靶比的情況下，針對Ra j i、SK0V3和 ANTI三種細胞，在相應(yīng)的抗體0. lμg/ml共同孵育的情況下，本發(fā)明Fc γ Rma-ΒΒ-ζ對靶細胞 的殺傷能力都明顯優(yōu)于Fc γ RIIIa-CD8a-BB-G。
[ΟΙ1 ?] 圖6-D示出了在不同的效革Ε1比的情況下，針對Ra j i細胞，在ri tuximab抗體0 . lyg/ ml共同孵育的情況下，F(xiàn)c yRHIa signal peptide-Fc yRHIa-CAR對革巴細胞的殺傷能力明顯 優(yōu)于⑶8aleader-Fc γ Rma-CAR。所以本發(fā)明優(yōu)選Fc γ Rma信號肽作為信號肽，而不用常規(guī) 的⑶8α前導(dǎo)序列。
[0117] 實施例8檢測IFN-γ分泌量
[0118] 抗體孵育的濃度為0 · lμg/ml，E: Τ = 1:1情況下對Raji細胞(CD20+，rituximab)、 SK0V3細胞（Her2+，trastuzumab)、ANT1細胞（CCR4+，mogamulizuma