b)共同孵育4個小時之 后，IFN-γ分泌水平的檢測，采用BD CBA assay kit。以K562和相應(yīng)抗體孵育作為對照組， 其結(jié)果如圖7所示。
[0119] 結(jié)果顯示，F(xiàn)cyRIIIa-BB^對Raji、SK0V3和ΑΝΤΙ三種細胞，在相應(yīng)的抗體0.1μg/ml 共同孵育的情況下，其細胞因子IFN-γ的分泌水平都明顯高于FcyRHIa-⑶8α-ΒΒ-ζ組。
[0120] 實施例9Fc γ Rma-ΒΒ-ζ慢病毒感染ΝΚ92試驗
[0121] ΝΚ92本身無 CD16a的表達，采用？〇丫1?111&-88氣轉(zhuǎn)導(dǎo)疆92細胞系，以未轉(zhuǎn)染疆92作 為對照，從而驗證Fey Rma-ΒΒ-ζ的特異性殺傷能力。其中NK92無 ADCC作用能力，該實驗用 于直接證明該CAR分子設(shè)計的優(yōu)勢。
[0122] NK92細胞參考ATCC說明進行培養(yǎng)，10M0I Fc yRina-BB-G慢病毒感染培養(yǎng)的NK92 細胞，以未轉(zhuǎn)染的NK92細胞作為對照，和抗體共同孵育研究對Raji細胞（CD20+， rituximab)、SK0V3細胞（Her2+，trastuzumab)、ΑΝΤΙ細胞（CCR4+，mogamulizumab)的殺傷能 力。NK92細胞本身缺失FcyRHIa的表達，其結(jié)果如圖8所示。
[0123] 經(jīng)過對照試驗確切說明嵌合Fc γ Rma-ΒΒ-ζ基因的NK92細胞具有ADCC的殺傷能 力；結(jié)果還顯示，相對于未轉(zhuǎn)染的ΝΚ92細胞，表達嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ的ΝΚ92細胞的殺 傷能力明顯提高，說明ΝΚ92細胞通過嵌合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ的ADCC作用起到針對性的殺 傷作用。
[0124] 實施例lOFc γ Rma-ΒΒ-ζ-NK的制備方法(用于異基因治療的產(chǎn)品化細胞制劑）。
[0125] 1、采用IL-15、IL-21細胞因子培養(yǎng)法從PBMC培養(yǎng)ΝΚ細胞，經(jīng)過14到21天的培養(yǎng)，ΝΚ 細胞純度達90%以上；
[0126] 2、收獲培養(yǎng)的NK細胞，DPBS洗滌三遍；
[0127] 3、加入生理鹽水重懸，調(diào)整細胞濃度為5X107/ml，加入O.Uig/ml治療性單克隆抗 體，4°C孵育45分鐘；
[0128] 4、1500rpm，10min離心收集抗體孵育后的細胞，加入含有10%DMS0的細胞凍存液， 調(diào)整細胞濃度為5X107/ml，置于細胞凍存袋中，超低溫冰箱過夜后轉(zhuǎn)移到液氮中保存；
[0129] 5、需要回輸該細胞時，液氮或者干冰運輸?shù)交剌數(shù)兀?7°C水浴鍋中快速解凍，之 后回輸回患者體內(nèi)；
[0130] 6、凍存復(fù)蘇后細胞功能驗證:細胞活率和殺傷能力試驗，其結(jié)果如圖9-10所示。
[0131 ]圖9顯示，凍存復(fù)蘇后細胞活率略有下降，仍能達到90 %以上的細胞活率，能夠滿 足臨床治療的需要。
[0132] 圖10顯示，凍存復(fù)蘇后的NK細胞依舊保留了單克隆抗體的ADCC作用能力，細胞殺 傷能力略有下降，細胞殺傷能力水平能夠滿足臨床治療的需求。復(fù)蘇后可以直接回輸患者， 能夠起到結(jié)合治療性單克隆抗體的ADCC作用。
[0133] 通過上述實施例可以看出，本發(fā)明在優(yōu)化CAR分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，設(shè)計的作用位點 為Fc γ Rma的CAR分子，其采用將Fc γ Rma細胞外區(qū)域直接與⑶8α跨膜區(qū)域連接，刪除了 CD8a鉸合區(qū)的獨特設(shè)計，不僅可與多種不同的單克隆抗體藥物聯(lián)合使用，用于多種腫瘤的 治療，同時與含有CD8a鉸合區(qū)的結(jié)構(gòu)相比，其更有利于激活效應(yīng)細胞，能更進一步發(fā)揮CAR 分子對腫瘤細胞的高效殺傷功能；同時，該設(shè)計的嵌合Fc γ Rma基因的免疫細胞，體外擴增 后回輸患者體內(nèi)，補充有功能的ADCC效應(yīng)細胞，在單克隆抗體藥物的介導(dǎo)下特異性識別腫 瘤細胞，同時通過CAR分子起到對腫瘤細胞的殺傷作用。
[0134] 申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并 不局限于上述詳細結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細結(jié)構(gòu)特征才能實施。所 屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用部件的等效替換 以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
[0135] 以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中 的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這 些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0136] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0137] 此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1. 一種基于Fc γ Rma的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因包括依次串聯(lián)的Fc γ Rm a信號肽、Fc γ Rma細胞外區(qū)域、⑶8α跨膜區(qū)域和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述Fc γ Rma細胞 外區(qū)域直接與CD8a跨膜區(qū)域連接。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述Fey Rma信號肽具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，其編碼基因序列如SEQ ID NO: 3所示； 優(yōu)選地，所述Fey Rma細胞外區(qū)域具有如SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列，其編碼基因 序列如SEQ ID NO:4所示； 優(yōu)選地，所述⑶8α跨膜區(qū)域具有如SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列，其編碼基因序列 如SEQ ID NO:5所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因還含有Kozak序列； 所述Kozak序列如SEQ ID NO:2所示； 優(yōu)選地，所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域由共刺激分子和細胞活化信號拼接而成； 優(yōu)選地，所述共刺激分子為 CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、LFA-1、 ⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或⑶83中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為⑶28或4-1BB 中的任意一種或兩種的組合，進一步優(yōu)選為4-1BB; 優(yōu)選地，所述4-lBB具有如SEQIDN0:ll所示的氨基酸序列，其編碼基因序列如SEQID NO: 6所示； 優(yōu)選地，所述細胞活化信號為CD3G信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域； 優(yōu)選地，所述CD3G信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域具有如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，其編碼基 因序列如SEQ ID NO:7所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因是由Kozak序列、 Fc γ Rma信號肽、Fc γ Rma細胞外區(qū)域、CD8a跨膜區(qū)域、共刺激分子和⑶3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 依次串聯(lián)拼接而成，所述FcyRHIa細胞外區(qū)域直接與CD8a跨膜區(qū)域連接，不含有CD8a鉸合 區(qū)； 優(yōu)選地，所述嵌合基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。5. -種重組表達載體，其包含如權(quán)利要求1-4之一所述的嵌合基因。6. -種細胞，其表達如權(quán)利要求1-4之一所述的嵌合基因或含有如權(quán)利要求5所述的重 組表達載體； 優(yōu)選地，所述細胞為T細胞、NK細胞或DC細胞中的任意一種； 優(yōu)選地，所述T細胞為中心記憶T細胞、效應(yīng)記憶T細胞或效應(yīng)T細胞中的任意一種； 優(yōu)選地，所述NK細胞為原代培養(yǎng)的NK細胞或NK92細胞系。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞在制備預(yù)防和/或治療和/或輔助治療惡性腫瘤或者病毒 感染性疾病的藥物中的用途。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述細胞與單克隆抗體聯(lián)合使用； 優(yōu)選地，所述單克隆抗體為CD20、CD52、Her-l/2、EGFR、VEGF、CD117或ro-l中的任意一 種或至少兩種的混合物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途，所述嵌合基因包括依次串聯(lián)的FcγRⅢa信號肽、FcγRⅢa細胞外區(qū)域、CD8α跨膜區(qū)域和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述FcγRⅢa細胞外區(qū)域直接與CD8α跨膜區(qū)域連接；本發(fā)明通過將FcγRⅢa細胞外結(jié)構(gòu)域直接與CD8α跨膜區(qū)連接，刪除了常規(guī)嵌合抗原受體(CAR)分子設(shè)計中的CD8α鉸合區(qū)，使得該種FcγRⅢa-CAR分子更有利于激活效應(yīng)細胞，顯著提高了FcγRⅢa-CAR分子對腫瘤細胞的殺傷能力；該種設(shè)計的FcγRⅢa-CAR分子與單克隆抗體藥物聯(lián)合可通用于多種腫瘤的細胞治療。
【IPC分類】A61K38/17, A61P31/12, C12N15/63, C12N5/10, A61K45/06, A61P35/00, C12N15/62
【公開號】CN105647946
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】孫振華
【申請人】蘇州康元生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月18日