分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于土壤科學(xué)領(lǐng)域，涉及植物營養(yǎng)學(xué)及植物生理學(xué)研究方法，尤其涉及一種分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自從1840年李比希(Liebig)創(chuàng)立了“植物礦質(zhì)營養(yǎng)學(xué)說”起，大多數(shù)的研究都針對無機氮展開，而有機營養(yǎng)的研究而相對落后。近十年的研究表明，大多數(shù)植物具備吸收氨基酸、多肽、核酸，甚至大分子蛋白質(zhì)的能力。盡管植物可以吸收有機氮已經(jīng)成為共識，但自然環(huán)境下土壤氨基酸周轉(zhuǎn)迅速，因此自然環(huán)境下氨基酸的營養(yǎng)貢獻仍沒有定論。Lipson等根據(jù)植物-微生物競爭吸收的模型，計算出氨基酸對高山植物的營養(yǎng)貢獻率不低于50 %。然而，在亞熱帶地區(qū)，根據(jù)13C，15N雙標(biāo)記技術(shù)研究得出其營養(yǎng)貢獻率低于1%。從不同地區(qū)氨基酸營養(yǎng)貢獻的差異可以看出，環(huán)境條件對氨基酸營養(yǎng)貢獻具有重要的作用。
[0003]環(huán)境因子包括溫度、光照強度、二氧化碳濃度、土壤氮素組成及含量、土壤酸度、土壤結(jié)構(gòu)、土壤污染物組成及濃度等，這些因子會對氨基酸營養(yǎng)貢獻產(chǎn)生較大的影響。這些因素不止影響土壤中氨基酸的生物有效性，還會對植物根系吸收、根系到地上部的轉(zhuǎn)運、根系及地上部氨基酸的代謝等產(chǎn)生較大的影響。然而，關(guān)于該方面的研究及研究方法相對缺乏，缺少系統(tǒng)準(zhǔn)確的測定影響作用的方法，尤其是從植物營養(yǎng)和植物生理角度綜合分析環(huán)境因素對氨基酸營養(yǎng)代謝的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在解決研究環(huán)境因素對氨基酸吸收代謝影響方法缺乏的問題，提供一種分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法，是一種采用同位素示蹤技術(shù)及氣相色譜_同位素質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法。
[0005]本發(fā)明方法通過以下步驟實現(xiàn):
[0006]1.環(huán)境因子對氨基酸長期吸收的影響
[0007]采用無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法:以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇生長狀態(tài)一致的植物，更換為3mM 5-55 % 15N-甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，設(shè)置相應(yīng)的環(huán)境條件，如光照強度、營養(yǎng)液pH、C02濃度等，每2-3d更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)6-25d后破壞性采樣，將植物根系與地上部分開，根系于清水中清洗三次，接著放置于超聲波清洗機中清洗I分鐘，采用0.5M氯化鈣溶液清洗三次，最后用純凈水沖洗三次，以去除吸附于根系上的15N,采用冷凍干燥或者烘箱烘干后，將根系和地上部一起放于球磨儀中粉碎，采用同位素質(zhì)譜分析不同環(huán)境條件下處理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，根據(jù)此步驟可以分析環(huán)境因素對植物生長及氨基酸吸收的長期影響；
[0008]2.環(huán)境因子對氨基酸短期吸收及吸收方式的影響
[0009]采用如步驟I所述的培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇生長狀態(tài)一致的植物，采用滅菌純凈水多次沖洗根系及離心管后，將植物放置于清水中8-10h，之后將其根系放置于50μπιΟ1 L-1CCCP溶液中I小時，使其根系失活，然后以不用CCCP處理的幼苗做對照，將植物放置于含3mM 98.1Oat.%15N_甘氨酸的營養(yǎng)液中，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，進行標(biāo)記氨基酸的短期吸收及吸收方式試驗，設(shè)置相應(yīng)的環(huán)境條件，如光照強度、營養(yǎng)液pH、CO2濃度等，培養(yǎng)2-6h后破壞性采樣，將植物根系與地上部分開，根系放于清水中清洗三次，接著放置于超聲波清洗機中清洗I分鐘，采用0.5M氯化鈣溶液清洗三次，最后用純凈水沖洗三次，以去除吸附于根系上的15N,采用冷凍干燥或者烘箱烘干后，將根系和地上部一起放于球磨儀中粉碎，采用同位素質(zhì)譜分析不同環(huán)境條件下處理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，根據(jù)步驟I的結(jié)果，可以確定環(huán)境因子對甘氨酸吸收的長期效應(yīng)，即對吸收和后續(xù)代謝的影響，而根據(jù)步驟2的短期吸收結(jié)果，可以分析環(huán)境因素對根系吸收及吸收方式的影響，進而推測影響甘氨酸營養(yǎng)貢獻的限速步驟。
[0010]3.環(huán)境因子對氨基酸在植物體內(nèi)代謝的影響
[0011 ]采用步驟I所述的無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇生長狀態(tài)一致的植物，采用滅菌純凈水多次沖洗根系及離心管后，將植物放置于清水中8-24h，之后更換為3mM 50-99.8 % 15N-甘氨酸為氮源，，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，設(shè)置相應(yīng)的環(huán)境條件，如光照強度、營養(yǎng)液pH、CO2濃度等，培養(yǎng)10-24h后破壞性采樣，將植物根系于清水中清洗三次，接著放置于超聲波清洗機中清洗I分鐘，采用0.5M氯化鈣溶液清洗三次，最后用純凈水沖洗三次，以去除吸附于根系上的15N,采用冷凍干燥或者烘箱烘干后，將根系和植物地上部一起放于球磨儀中粉碎;稱取20mg經(jīng)干燥后粉碎的植物樣品，加4ml 80%乙醇放置于震蕩機中以10-30r/min震蕩提取lh，提取液在3500-4500g/min離心15min，保留上清液，殘渣用Iml 80 %乙醇再提取Ih，10000-12000g離心5-15min，兩次離心的上清液混合，采用N2吹干或者低溫低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于25-35°C下蒸干，再次用2ml 0.lmol/L HCl溶解，在10000-15000r/min轉(zhuǎn)速下離心10_15min，上清液傾倒于體積為2cm3的陽離子交換柱中(Dowex 50WX8-200)，該陽離子交換柱采用20ml超純水清洗，其中的氨基酸采用20ml4mol/LNH40H洗脫，洗脫液氮吹過夜，去除其中的NH3，之后冷凍干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的叔丁基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸濃度及15N豐度采用氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測(GasChromatography Mass Spectrometry)ο
[0012]采用步驟I可以研究環(huán)境因素對植物長期吸收的影響，而步驟2主要研究環(huán)境因素對植物根系吸收能力的影響，步驟3主要研究環(huán)境因素對植物體內(nèi)氨基酸代謝的影響，結(jié)合三方面結(jié)果，就可以綜合評價環(huán)境因素對植物吸收利用氨基酸的影響，并解釋具體的代謝限速步驟。
[0013]本發(fā)明通過采用無菌培養(yǎng)結(jié)合同位素示蹤技術(shù)，研究環(huán)境因素對植物生長及氨基酸吸收的影響，確定環(huán)境因素的長期效應(yīng)，之后采用短期吸收及添加代謝抑制劑的方法，研究環(huán)境因素對根系短期吸收氨基酸及吸收方式的影響，最后采用同位素示蹤結(jié)合氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)，確定環(huán)境因素限制甘氨酸代謝的限速步驟。該方法操作簡單，采用的同位素示蹤技術(shù)及氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)精密度和可信度較高，可以有效的分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻的機理，解決研究環(huán)境因素對氨基酸吸收代謝影響方法缺乏的問題。
【附圖說明】
[0014]圖1是光照強度對甘氨酸長期吸收的影響。
[0015]圖2是光照強度對甘氨酸短期吸收的影響。
[0016]圖3是光照強度對小白菜地上部含15N氨基酸的影響。
[0017]圖4是光照強度對小白菜根系含15N氨基酸的影響。
[0018]圖5是營養(yǎng)液酸度對甘氨酸長期吸收的影響。
[0019]圖6是營養(yǎng)液酸度對甘氨酸短期吸收的影響。
[0020]圖7是營養(yǎng)液酸度對小白菜地上部含15N氨基酸的影響。
[0021 ]圖8是營養(yǎng)液酸度對小白菜根系含15N氨基酸的影響。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0023]實施例1一種分析光照強度影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法
[0024]操作步驟如下:
[0025]步驟一:光照強度對氨基酸長期吸收的影響(以小白菜為例)
[0026]采用無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸錢+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)小白菜25d后，選擇生長狀態(tài)一致的小白菜，更換為3mM 50.16 % 15N-甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，設(shè)置光照條件為90、360、540ymol m—2s—1 (前期研究表明360ymol m—2S+1強度下最適合小白菜生長，而90和540μπιΟ1 m—S—1強度下則分別過低和過高)，每2d更