的限速步驟。
[0042]步驟三:營養(yǎng)液酸度對(duì)氨基酸在植物體內(nèi)代謝的影響
[0043]采用如步驟一所述的無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，在50ml離心管中培養(yǎng)小白菜25d后，選擇生長狀態(tài)一致的小白菜，采用滅菌純凈水多次沖洗根系及離心管后，將小白菜放置于清水中10h，之后更換為3mM 99.81%15N-甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，設(shè)置營養(yǎng)液酸度條件為pH =
4.0、6.0、8.0，培養(yǎng)12h后破壞性采樣，將小白菜根系于清水中清洗三次，接著放置于超聲波清洗機(jī)中清洗I分鐘，采用0.5M氯化鈣溶液清洗三次，最后用純凈水沖洗三次，以去除吸附于根系上的15N，采用冷凍干燥法或者烘箱烘干后，將根系和小白菜地上部一起放于球磨儀中粉碎;稱取20mg經(jīng)干燥后粉碎的植物樣品，加4ml 80%乙醇放置于震蕩機(jī)中以30r/min震蕩提取lh，提取液在4500g/min離心15min，保留上清液，殘?jiān)肐ml 80%乙醇再提取Ih，15000g離心1min，兩次離心的上清液混合，采用低溫低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于25 °C下蒸干，再次用2ml 0.lmol/L HCl溶解，在15000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，上清液傾倒于體積為2cm3的陽離子交換柱中(Dowex50WX8-200in the H+form)，該陽離子交換柱采用20ml超純水清洗，其中的氨基酸采用20ml4mol/LNH40H洗脫，洗脫液氮吹過夜，去除其中的NH3，之后冷凍干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的叔丁基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸濃度及15N豐度采用氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行檢測。根據(jù)步驟一和步驟二的結(jié)果，可以推測影響氨基酸的生物有效性的限速步驟，而步驟三可驗(yàn)證步驟二的限速步驟，并進(jìn)一步揭示氨基酸代謝的具體限速步驟。
[0044]采用步驟一可以研究營養(yǎng)液酸度對(duì)植物長期吸收的影響，而步驟二主要研究營養(yǎng)液酸度對(duì)植物根系吸收能力的影響，步驟三主要研究營養(yǎng)液酸度對(duì)植物體內(nèi)氨基酸代謝的影響，結(jié)合三方面結(jié)果，就可以綜合評(píng)價(jià)營養(yǎng)液酸度對(duì)植物吸收利用氨基酸的影響，并解釋具體的代謝限速步驟。
[0045]圖5表明，以甘氨酸為氮源，最適宜小白菜吸收甘氨酸的營養(yǎng)液酸度為PH=7.0，pH=4.0嚴(yán)重限制了甘氨酸的吸收及小白菜的生長，pH=8.0也一定程度上限制了甘氨酸的吸收。
[0046]從圖6可以看出，營養(yǎng)液酸度對(duì)甘氨酸吸收及吸收方式具有顯著的影響。pH= 4營養(yǎng)液處理，小白菜被動(dòng)吸收量顯著高于其他兩種酸度處理，總吸收量與PH= 7相當(dāng)。而在pH=8營養(yǎng)液處理，小白菜主動(dòng)吸收與被動(dòng)吸收量均顯著低于pH = 7處理，表明pH=8條件下根系吸收限制了小白菜甘氨酸的營養(yǎng)貢獻(xiàn)，而pH=4條件下甘氨酸吸收不是限制因素。
[0047]從圖7可以看出，各處理間除銨態(tài)氮及總吸收量外，其余各種氨基酸均未表現(xiàn)出顯著性差異，表明營養(yǎng)液酸度對(duì)地上部的影響較小。
[0048]從圖8看出，營養(yǎng)液酸度對(duì)根系氨基酸含量的影響要大于地上部。pH=4條件下，甘氨酸含量顯著高于pH = 7處理，表明甘氨酸向絲氨酸的轉(zhuǎn)化是限制pH=4條件下氨基酸營養(yǎng)貢獻(xiàn)的限制因子。值得注意的是，盡管甘氨酸的營養(yǎng)貢獻(xiàn)在pH = 7條件下最高，但其根系中卻呈現(xiàn)了較高的氨態(tài)氮含量，表明銨態(tài)氮的積累是限制了氨基酸營養(yǎng)的重要因素。研究表明，排除環(huán)境因素的干擾，限制植物吸收利用氨基酸的主要問題則是此生代謝產(chǎn)生的銨態(tài)氮的同化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻(xiàn)機(jī)理的方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)環(huán)境因子對(duì)氨基酸長期吸收的影響 采用無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法:以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇生長狀態(tài)一致的植物，更換為3mM 5-55 % 15N-甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，設(shè)置光照強(qiáng)度、營養(yǎng)液pH、C02濃度相應(yīng)的環(huán)境條件，每2-3d更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)6-25d后破壞性采樣，將植物根系與地上部分開，去除吸附于根系上的15N,清洗根系，接著放置于超聲波清洗機(jī)中清洗，再用0.5M氯化鈣溶液清洗，最后用純凈水沖洗，干燥后，將根系和地上部一起放于球磨儀中粉碎，采用同位素質(zhì)譜分析不同環(huán)境條件下處理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析環(huán)境因素對(duì)植物生長及氨基酸吸收的長期影響； (2)環(huán)境因子對(duì)氨基酸短期吸收及吸收方式的影響 采用步驟(I)所述的無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇生長狀態(tài)一致的植物，采用滅菌純凈水沖洗根系及離心管后，將植物放置于清水中8-10h，之后將其根系放置于50μπιΟ1 L-1CCCP溶液中I小時(shí)，使其根系失活，然后以不用CCCP處理的幼苗做對(duì)照，將植物放置于含3mM 98.1Oat.%15N_甘氨酸的營養(yǎng)液中，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，進(jìn)行標(biāo)記氨基酸的短期吸收及吸收方式試驗(yàn)，設(shè)置光照強(qiáng)度、營養(yǎng)液pH、C02濃度相應(yīng)的環(huán)境條件，培養(yǎng)2-6h后破壞性米樣，將植物根系與地上部分開，根系放于清水中清洗，接著放置于超聲波清洗機(jī)中清洗，再用0.5M氯化鈣溶液清洗，最后用純凈水沖洗，以去除吸附于根系上的15N,干燥后，將根系和地上部一起放于球磨儀中粉碎，采用同位素質(zhì)譜分析不同環(huán)境條件下處理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析環(huán)境因素對(duì)根系吸收及吸收方式的影響，進(jìn)而分析影響甘氨酸營養(yǎng)貢獻(xiàn)的限速步驟； (3)環(huán)境因子對(duì)氨基酸在植物體內(nèi)代謝的影響 采用步驟(I)所述的無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇生長狀態(tài)一致的植物，采用滅菌純凈水沖洗根系及離心管后，將植物放置于清水中8-24h，之后更換為3mM 50-99.8% 15N-甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，設(shè)置相應(yīng)的環(huán)境條件，如光照強(qiáng)度、營養(yǎng)液pH、⑶2濃度等，培養(yǎng)10-24h后破壞性采樣，將植物根系于清水中清洗，接著放置于超聲波清洗機(jī)中清洗，再用0.5M氯化鈣溶液清洗，最后用純凈水沖洗，以去除吸附于根系上的15N,干燥后，將根系和植物地上部一起放于球磨儀中粉碎;稱取20mg經(jīng)干燥后粉碎的植物樣品，加4ml 80%乙醇放置于震蕩機(jī)中以10-30r/min震蕩提取lh，提取液在3500-4500g/min離心15min，保留上清液，殘?jiān)肐ml80%乙醇再提取Ih，10000-12000g離心5-15min，兩次離心的上清液混合，采用N2吹干或者低溫低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于25-350C下蒸干，再次用2ml 0.lmol/L HCl溶解，在10000-15000r/min轉(zhuǎn)速下離心10-15min，上清液傾倒于體積為2cm3的陽離子交換柱中，該陽離子交換柱采用20ml超純水清洗，其中的氨基酸采用20ml 4mol/LNH40H洗脫，洗脫液氮吹過夜，去除其中的NH3,之后冷凍干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的叔丁基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸濃度及15N豐度采用氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定氨基酸代謝限速步驟的方法，其特征在于，步驟(I)_(3)中所述干燥，選用冷凍干燥或者烘箱烘干。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定氨基酸代謝限速步驟的方法，其特征在于，結(jié)合(I)_(3)的結(jié)果，綜合評(píng)價(jià)環(huán)境因素對(duì)植物吸收利用氨基酸的影響，測定氨基酸代謝限速步驟。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻(xiàn)機(jī)理的方法，采用無菌培養(yǎng)結(jié)合同位素示蹤技術(shù)，研究環(huán)境因素對(duì)植物生長及氨基酸吸收的影響，確定環(huán)境因素的長期效應(yīng)，之后采用短期吸收及添加代謝抑制劑的方法，研究環(huán)境因素對(duì)根系短期吸收氨基酸及吸收方式的影響，最后采用同位素示蹤結(jié)合氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)，確定環(huán)境因素限制甘氨酸代謝的限速步驟。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，操作簡單，采用的同位素示蹤技術(shù)及氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)精密度和可信度較高，可有效的分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻(xiàn)的機(jī)理。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號(hào)】CN105651888
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】馬慶旭, 吳良?xì)g
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年1月8日