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文檔序號:9892659閱讀:來源:國知局
er473,Cst#9271 )和抗磷酸Erkl/2 (ph〇pSh〇-Tyr202/Tyr204,CstM377)檢驗硝化纖維膜。對膜進(jìn)行光密度分析之后,抗€(-Tubul ine( Cs t#2144)標(biāo)記的Tubuline 用于歸一化。
[0168] g)在HUVEC細(xì)胞試驗中的Akt和ERKv2磷酸化(在饑餓條件下)
[0169] 將HUVEC細(xì)胞(Lonza)播種在白色6孔多孔板中的完全EGM2培養(yǎng)基(Lonza)中24小 時,每孔0.3xl0 6個細(xì)胞,每孔2mL。在900yL靜態(tài)培養(yǎng)基中,用血清使細(xì)胞額外饑餓24小時。 在37°C,在IOOyL體積下,將高濃度的化合物A、BAF-312或芬戈莫德(IOX)加入到每個孔中, 保持10分鐘。除去培養(yǎng)基之后,用冷的PBS沖洗細(xì)胞,并將細(xì)胞在冰上、在含有l(wèi)%triton、蛋 白酶和磷酸酶抑制劑的冷的IOOyL RIPA緩沖液中溶解。為了進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡,將30yg總蛋 白溶解產(chǎn)物裝填到4-12%bis-tris凝膠(Invitrogen)中。在迀移和轉(zhuǎn)移之后,用抗磷酸Akt (Phospho_Ser473,Cst#2965)和抗磷酸 Erki/2(phopsho_Tyr202/Tyr204,Cst#4377)檢驗硝 化纖維膜。對膜進(jìn)行光密度分析之后,抗a-Tubuline(Cst#2144)標(biāo)記的Tubuline用于歸一 化。
[0170] h)衣霉素引起的細(xì)胞程序死亡試驗
[0171] 利用Caspase-Glo 3/7試驗試劑盒(Promega)的方法,在RPTEC中,測定化合物A對 衣霉素(TN)引起的細(xì)胞程序死亡的影響。簡要地說,將RPTEC細(xì)胞(Lonza)播種在白色96孔 多孔板中的REGM(REBM培養(yǎng)基加上0.5 %FCS加上Singlequots,Lonza)培養(yǎng)基中,每孔 30xl03個細(xì)胞,并附著24小時。24小時之后,用血清和不含補充物的培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基 (56yL/孔)。將細(xì)胞用化合物A(最終濃度0.3-30μΜ,7yL)預(yù)先處理30分鐘,而后加入衣霉素 (TN,最終濃度0. lyg/mL,7yL)。在37 °C、5 %⑶2條件下保持24小時之后,加入半胱天冬酶-Glo試劑,并在搖動下將培養(yǎng)板放置1小時。用Envision讀數(shù)器(Perkin Elmer)的方法,記錄 熒光。結(jié)果用TN引起的細(xì)胞程序死亡的百分比抑制來表示。
[0172] i )TNFa引起的粘附分子的過表達(dá)試驗
[0173] 利用ELISA,在HUVEC中,測定扣厶1-1、¥0厶1-1和?/^-選擇蛋白表達(dá)。在10(^1^的體積 下,將HUVEC細(xì)胞播種在96孔多孔板中的EGM2培養(yǎng)基(Lonza)中,每孔25xl0 3個細(xì)胞,并附著 24小時。24小時之后,用靜態(tài)培養(yǎng)基(不含補充物和血清的EGM2)替換完全培養(yǎng)基,保持3小 時.隨后,將細(xì)胞用化合物A或BAF-312(l-30yM)預(yù)先處理18小時。然后,在不含生長因子的 培養(yǎng)基中,將細(xì)胞用TNF-α(3ng/mL)再處理6小時。除去培養(yǎng)基,洗滌細(xì)胞,并且在4°C,每個 孔用IOOyL RLC2溶液(Alphelys#01-RLC2-RTU30)固定20分鐘。將固定的細(xì)胞用IOOyL HBSS 洗滌兩次,而后加入抗體抗ICAM-I (#BBA3,R&D System)、抗VCAM-I (#BBA5,R&D System)和 抗P/E-選擇蛋白,R&D system),保持I小時。徹底洗滌之后,加入抗小鼠 IgG HRP(# NA931,Amersham),保持2小時。洗滌并加入HRP底物(〇ro,Sigma#P9187)之后,讀取450nm (Envision)下的光密度。結(jié)果用TNF-α引起的粘附分子表達(dá)的百分比抑制來表示。
[0174] j)利用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行阻抗測定試驗
[0175] I. CHO 細(xì)胞
[0176] 源于CEREP的阻抗試驗用于測定化合物A、BAF-312和芬戈莫德對SlPj^EC5O活性。
[0177] 2.內(nèi)皮細(xì)胞
[0178] 濃度依賴性檢驗化合物A、BAF-312、芬戈莫德、SEW2871和SIP (用作陽性對照)對形 變的影響,利用電阻抗(X-celligence system)的變化檢測這種形變,監(jiān)測SlPi受體在人類 表皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)和人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)上的靈敏度降低狀況。在第1 天,將原初細(xì)胞播種到預(yù)先涂有膠原-I的96孔E-板中,每孔20,000個細(xì)胞。粘附并繁殖24小 時之后,用SlP(IyM)、化合物A(對于HDMEC: ΙμΜ;對于HUVEC:0 · I、1、ΙΟμΜ)、BAF-312(只在 HUVEC中,I、10、IOOnM)、芬戈莫德(對于HDMEC: IOOnM;對于HUVEC: I、10、IOOnM)或SEW2871 (只在HUVEC中,0 · I、1、10μΜ)第一次刺激HDMEC和HUVEC 1小時。用SlPR激動劑培養(yǎng)之后,將 細(xì)胞用培養(yǎng)基小心地洗滌兩次,而后恢復(fù)5.5小時。然后,使用增加濃度31?(0.1、1和1(^1〇 進(jìn)行第二次刺激,評價前面第一次刺激對受體靈敏度降低的影響,并測定所得的阻抗。至少 一式三份地進(jìn)行所有測定。在HDMEC中,所有第一次刺激的濃度大于EC 9Q。結(jié)果用平均值+/-s. e .m形式的隨機阻抗單位來表示。
[0179] 5.體內(nèi)藥理學(xué)
[0180] a)腎臟缺血再灌注(I/R)損傷的大鼠模型
[0181] 在腎臟缺血之前一個小時,使雄性Fischer大鼠(η = 3-9,250至300g) (Charles River Laboratory ,France) 口 服接受化合物A(0 · 3、1和3mg/kg)或BAF_312(3、10和30mg/ kg)或載體(0.6%甲基纖維素-0.5%tween 80,在水中),給藥體積在2mL/kg之內(nèi)。在第二組 實驗中,b. i . d.給予5天化合物A,評價潛在的快速減敏性。簡要地說,在戊巴比妥(50mg/kg, i.P.)麻醉下,對動物進(jìn)行假手術(shù)(即,剖腹手術(shù),腎動脈分離)或進(jìn)行25分鐘雙側(cè)腎動脈封 閉。為了使手術(shù)過程標(biāo)準(zhǔn)化并限制個體差異,小心地監(jiān)測體溫(37°C_38°C)和水化狀況(腹 膜注射生理血清)。在缺血時間結(jié)束時,除去夾鉗,使腎臟再灌注,并控制再灌注的特性,而 后縫合肌肉和皮膚(將再灌注差的動物立即排除)。二十四小時后,采集血液和腎臟。將血液 離心(3000g,10分鐘),將肝素化血漿冷凍,并使用生物化學(xué)分析器(P400,Horiba,F(xiàn)rance) 評價肌酸酐。將一個腎冷凍,進(jìn)行W e s t e r η印跡分析,評價組織白蛋白(抗白蛋白,S a n t a Cruz)和組織HSP70(單克隆抗HSP70抗體,從Santa Cruz獲得,#SC32239),將第二個腎固定 (10%中性-緩沖的福爾馬林)并用石蠟包埋,在5?m厚切片上進(jìn)行組織分析(急性腎小管壞 死定量,使用傳統(tǒng)的蘇木精-真曙紅-Saff ran,改進(jìn)的Masson's三色(trichrome)和過碘酸-希夫氏相關(guān)的阿新藍(lán)(blue alcine))和免疫組織化學(xué)分析(用單克隆抗⑶68抗體染色的巨 噬細(xì)胞,從Acris獲得,#BM4000,用單克隆抗PECAM抗體染色的毛細(xì)管,從Santa Cruz獲得,# SC1506,使用Ventana robot,VMS Inc·)。用腎皮質(zhì)延髓區(qū)域的12-15區(qū)域中所呈現(xiàn)出的細(xì) 胞壞死的腎小管的百分比來表示急性腎小管壞死。用正圖像數(shù)(Aperio算法)占全部的百分 比來表示⑶68和PECAM免疫標(biāo)記。血漿肌酸酐用平均值+/-S. e. m來表示。
[0182] b)橫紋肌溶解引起的腎損傷的小鼠模型
[0183] 在注射甘油之前一個小時,使Swi ss (CDl)雄性小鼠(η = 5-15, 13-14周大) (Charles River Laboratory,F(xiàn)rance) 口 服接受化合物Α(0 · 3、1、3和10mg/kg)或載體 (0.6%甲基纖維素-0 · 5%tween 80,在水中),給藥體積在10mL/kg之內(nèi)。在戊巴比妥(33mg/ kg)和氯胺酮(40mg/kg)麻醉下,將8mL/kg的甘油(50%v/v,在PBS中)或載體(PBS)肌內(nèi)注射 到后肢中(每個腿、腓腸肌和股直肌注射2次)。二十四小時后,采集血液,離心(3000g,10分 鐘),將肝素化血漿冷凍,并使用生物化學(xué)分析器(P400,H〇riba,F(xiàn)ranCe)評價肌酸酐。結(jié)果 用平均值+/-S. e .m來表示。
[0184] 結(jié)果
[0185] 為了證明按照本發(fā)明的化合物(即化合物A)在AKI環(huán)境下的活性和它相對于SlP1 功能性拮抗劑的差異,對其進(jìn)行各種體外和體內(nèi)實驗。
[0186] 1-心血管功能安全性
[0187] 雖然化合物A是沒有功能性拮抗作用的SlP1激動劑,但是,潛在的靶向可能與SlP1 功能性拮抗劑相似。迄今為止,對于S1PV3/4/5化合物、芬戈莫德的混合物,已經(jīng)獲得了最多 的臨床經(jīng)驗,它引起房室阻滯和心動過緩(Schmouder等人2006,J Clin Pharmacol 46: 895-904)。還有很多臨床前的證據(jù),證明SlP3涉及這些心臟毒性,由此,為了克服這些限制, 該領(lǐng)域已經(jīng)開始鑒定選擇性的SlP 1化合物。然而,進(jìn)入到臨床階段的選擇性的SlPH^合物似 乎也引起心動過緩(Gergely等人2012,BJP 167:1035-1047),但目前它們對房室阻滯的影 響還是未知的。由此,為了評價化合物A的潛在心臟中毒,除了常規(guī)研究之外,還進(jìn)行了許多 研究。在hERG試驗中,化合物A的IC 5q值大于30μΜ。在兔浦肯野纖維試驗中,0.3至ΙΟμΜ的試驗 化合物沒有顯著的影響,不過,在26μΜ時觀察到作用電位減小。
[0188] 在狗遙測研究中,在30或100mg/kg ρ.ο.和10或30mg/kg i.v.(輸液30分鐘)時,沒 有觀察到對心率或房室傳導(dǎo)阻滯或任何其它ECG參數(shù)的影響。在兩個劑量下,血壓沒有顯著 變化。
[0189] 2-體內(nèi)腎臟藥理學(xué)
[0190] 腎臟缺血再灌注(I/R)損傷的大鼠模型用于模擬患者進(jìn)行心臟手術(shù)之后引起的腎 臟損傷。在該模型中,化合物A顯著地降低(85-90% )AKI的嚴(yán)重程度,這可以通過限制血清 肌酸酐(臨床上有效的生物標(biāo)志)的升高而得到反映(圖IA代表5個獨立的研究)。影響是劑 量依賴性的,并且在1和3mg/kg p. 〇 .時是統(tǒng)計上顯著的(圖1A)。組織分析表明,化合物A通 過防止白蛋白溢出(圖1C)和保護(hù)毛細(xì)管而對血管系統(tǒng)具有直接影響?;衔顰還防止腎臟 近端小管壞死、降低巨噬細(xì)胞滲透和升高腎臟HSP70蛋白(與腎臟缺血性損傷之后的修復(fù)相 關(guān)的標(biāo)志)。化合物A沒有顯示快速減敏的跡象,相比于單一給藥,在重復(fù)BID給藥5天之后仍 然保持相似的活性(圖1D)。
[0191] 在患者中,橫紋肌溶解是AKI的另一種顯著的病因,并且通過肌內(nèi)注射甘油而在小 鼠中再現(xiàn)。甘油引起漸進(jìn)性的肌肉損傷,同時釋放肌紅蛋白,隨后產(chǎn)生腎臟功能障礙。正如 在I/R模型中所觀察到的那樣,在該模型中,化合物A防止顯著的(在10mg/kg ρ.ο時,~ 85% )和劑量依賴的腎臟功能惡化(η = 3個獨立的研究)(圖2)。
[0192] 在腎臟缺血再灌注模型中,化合物A的影響類似于SlP1-選擇性功能性拮抗劑MF-312的影響。在體外試驗(包括內(nèi)皮試驗,參見表1)中,BAF-312對于大部分SlP 1的效果至少 為10倍以上,并且在大鼠中具有與化合物A相似的血漿/腎接觸量。然而,盡管BAF-312的效 能/接觸性能提高,但是,在缺血再灌注模型中,它沒有使血清肌酸酐降低40%以上,即使在 高達(dá)30mg/kg ρ·ο·的劑量下(圖1Β)。
[0193] 3-淋巴細(xì)胞減少性活性的分化
[0194] 通過SlP1活化SlP決定著淋巴細(xì)胞從淋巴結(jié)流出到血液中。這種SlP 1活化引起受體 內(nèi)化作用,而后受體再循環(huán)回到細(xì)胞表面,進(jìn)行重新活化。然而,SlP1功能性拮抗劑(芬戈莫 德、BAF-312)引起內(nèi)化SlP1的降解,由此導(dǎo)致細(xì)胞表面SlP1的顯著和持續(xù)減少。因此,正如臨 床前和臨床上所觀察到的那樣,SIP i功能性拮抗劑使血液淋巴細(xì)胞大量和持續(xù)減少。 (Mandala等人2〇〇2,Science 296:346-349 ;Gergely等人2012 ,BJP 167: IO35-HM7)。
[0195] 果然,在大鼠中,BAF-312引起極度(~80 % )和持續(xù)的淋巴細(xì)胞減少(圖3A、3B)。這 種狀況即使在劑量低到lmg/kg p.〇.(最低檢驗劑量)時也很明顯。在大鼠AKI模型中部分有 效的2個劑量是高劑量(10和30mg/kg p. 〇.,圖1B),并且代表高度淋巴細(xì)胞減少性劑量。與 此相反,1和3mg/kg p.o.的化合物A沒有顯示出淋巴細(xì)胞降低狀況,即使在大鼠中重復(fù)BID 給藥(3mg/kg p.〇)5天之后(圖3C)。高劑量的化合物A顯示出劑量依賴性淋巴細(xì)胞減少狀 況,但是,這些劑量代表比充分AKI保護(hù)作用所需要劑量更高的劑量。
[0196] 類似地,在3和10mg/kg時,沒有在小鼠中觀察到化合物A的淋巴細(xì)胞減少性活性 (圖
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