制備高純度的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及通過在允許產(chǎn)生肉毒桿菌毒素的條件下培養(yǎng)肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、并從所述肉毒桿菌毒素分離神經(jīng)毒性組分來制備高純度的肉毒桿菌毒素神經(jīng) 毒性組分的方法。另外，本發(fā)明涉及可通過本發(fā)明的方法獲得的高純度的肉毒桿菌毒素神 經(jīng)毒性組分及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肉毒桿菌毒素是針對人類的最強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)毒素。它們通過阻斷神經(jīng)肌肉接頭 處的乙酰膽堿釋放起作用，導(dǎo)致肌肉去神經(jīng)支配。肉毒桿菌毒素在其他周圍性膽堿能神經(jīng) 末梢處也具有活性并引起，例如，減少唾液分泌或出汗以及減輕面部的紋路和皺紋。由于它 們作用方式的特殊性，肉毒桿菌毒素的臨床應(yīng)用范圍在持續(xù)增長，并且肉毒桿菌毒素如今 被廣泛用作藥學(xué)美容品。
[0003] 肉毒桿菌毒素由特定梭菌菌屬合成和釋放，其形式為包含肉毒桿菌毒素分子（"神 經(jīng)毒性組分"）和相關(guān)的非毒性細(xì)菌蛋白質(zhì)(也稱為"復(fù)合蛋白質(zhì)"）的大復(fù)合體。所述復(fù)合蛋 白質(zhì)包括不同的非毒性血凝素 (HA)蛋白質(zhì)和非毒性的非血凝素 (NTNH)蛋白質(zhì)。所述毒素復(fù) 合體的分子量在七種不同的肉毒桿菌毒素血清型以3，(：，04^和6)之中為從約3001^ &至 約900kDa不等。所述復(fù)合蛋白質(zhì)給所述神經(jīng)毒性組分提供了穩(wěn)定性。與所述毒素復(fù)合體不 同，所述神經(jīng)毒性組分在它的分離和純粹形式、即沒有任何復(fù)合梭狀芽胞桿菌蛋白質(zhì)下，是 酸不穩(wěn)定性的并且不耐受胃腸道中的侵蝕性環(huán)境。
[0004] 對于全部七種已知的肉毒桿菌毒素血清型來說，所述神經(jīng)毒性組分是以分子量約 150kDa的無活性單鏈前體(未裂解的多肽)合成的。這種單鏈前體通過蛋白質(zhì)水解性裂解被 活化，產(chǎn)生二硫鍵連接的雙鏈蛋白質(zhì)。50kDa的輕鏈含有催化結(jié)構(gòu)域，而lOOkDa的重鏈含有 內(nèi)部易位結(jié)構(gòu)域和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述lOOkDa的重鏈介導(dǎo)了與突觸前膽堿能神經(jīng)末梢的 結(jié)合和毒素進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)化。所述50kDa的輕鏈負(fù)責(zé)毒性效應(yīng)，充當(dāng)鋅-內(nèi)肽酶和裂解負(fù)責(zé) 膜融合的特殊蛋白質(zhì)（SNARE復(fù)合體的蛋白質(zhì)）。通過破壞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的膜融合過程，肉毒桿 菌毒素阻止乙酰膽堿釋放到突觸間隙中。
[0005] 1989年，A血清型肉毒桿菌毒素復(fù)合體(BoNT/A-復(fù)合體)在美國首次被批準(zhǔn)為人類 所用，用于治療斜視、眼瞼痙攣和其他失調(diào)。如今，"A"形式的肉毒桿菌毒素復(fù)合體可從若干 來源商購，例如以商品名；Botox?得自Al 1 ersan、以商品名Dysport?:得自Ipsen、和以商品 名Azzalure"得自Galderma。
[0006] 然而，在相當(dāng)一部分情況下，患者響應(yīng)反復(fù)的ΒοΝΤ/Α-復(fù)合體注射產(chǎn)生中和抗體。 據(jù)認(rèn)為，這種效應(yīng)與BoNT/A-復(fù)合體的復(fù)合蛋白質(zhì)有關(guān)。受到影響的患者變成所謂的"繼發(fā) 性非應(yīng)答者（secondary non-responders)"，并且用ΒοΝΤ/Α-復(fù)合體治療不再有效。發(fā)現(xiàn)這 種抗體引起的治療失敗的風(fēng)險影響了不少于10%至20%的治療對象。與使用肉毒桿菌毒素 復(fù)合體有關(guān)的另一個缺點是它在注射到靶肌肉中之后的區(qū)域性或全身性擴(kuò)散。例如，利用 單纖維肌電圖（SF-EMG)的研究顯示在遠(yuǎn)離注射部位的肌肉中抖動增加。
[0007] 在施用純神經(jīng)毒性組分時，觀察不到這些缺點。特別是，施用純神經(jīng)毒性組分降低 了不響應(yīng)或響應(yīng)降低的風(fēng)險，這對于進(jìn)行長期治療的患者特別重要。與純神經(jīng)毒性組分有 關(guān)的其他利益包括快速發(fā)病效應(yīng)和優(yōu)良的溫度穩(wěn)定性，所述溫度穩(wěn)定性甚至消除了對冷藏 鏈和在冰箱中儲存的需要。只含有A型神經(jīng)毒性組分而沒有任何復(fù)合蛋白質(zhì)的制劑可從 Merz 以商品名 Xeomin '和 Boconture '商購。
[0008] 所述神經(jīng)毒性組分可通過培養(yǎng)產(chǎn)生肉毒桿菌毒素的梭狀芽胞桿菌菌株并通過一 系列沉淀和色譜步驟從所產(chǎn)生的肉毒桿菌毒素復(fù)合體分離所述神經(jīng)毒性組分而制備。如果 使用天然存在的梭狀芽胞桿菌菌株，則肉毒桿菌毒素以其活性的急性毒性形式由梭狀芽胞 桿菌產(chǎn)生和釋放。因此，必須采取專門的措施來避免對生產(chǎn)肉毒桿菌毒素和/或從所述毒素 復(fù)合體提純神經(jīng)毒性組分所涉及的人員的不利健康后果。為了減少暴露于毒性氣溶膠的風(fēng) 險，W0 2006/133818 A1提議，例如，在以低于周圍生產(chǎn)室壓力的較低壓力下運(yùn)行的隔離器 中進(jìn)行肉毒桿菌毒素的生產(chǎn)，以避免操作者與任何毒性物質(zhì)的接觸。
[0009] 雖然W0 2006/133818 A1中描述的制造過程確保了足夠的操作安全性，但它在所 產(chǎn)生的神經(jīng)毒性組分的純度方面仍然留有改進(jìn)的余地。在制藥工業(yè)中，高化學(xué)和微生物純 度是至關(guān)重要的。因此，藥物開發(fā)者的最終目標(biāo)是達(dá)到盡可能高的藥物純度以建立期望的 安全性和功效。
[0010] 因此，本發(fā)明的目的是提供以安全的方式制備高純度的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組 分的改進(jìn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 在第一方面，本發(fā)明提供了制備高純度的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分的方法，所 述方法包含以下步驟：
[0012] (a)在允許產(chǎn)生肉毒桿菌毒素的條件下培養(yǎng)肉毒桿菌，和
[0013] (b)從所述肉毒桿菌毒素分離神經(jīng)毒性組分，
[0014] 其中培養(yǎng)步驟(a)和分離步驟(b)在壓力梯度裝置中進(jìn)行，所述裝置包含第一隔離 器單元，其含有培養(yǎng)肉毒桿菌的發(fā)酵罐，和任選的第二或另一個隔離器單元，以及安全工作 臺，所述工作臺是II級BSC(生物安全柜），配備了允許將材料無菌傳送進(jìn)出所述BSC的傳送 系統(tǒng)。
[0015] 所述第一和第二或另一個隔離器單元位于生產(chǎn)室，所述生產(chǎn)室通過氣鎖與環(huán)境通 連，其中所述第一和第二或另一個隔離器單元中的壓力低于生產(chǎn)室中的壓力，生產(chǎn)室中的 壓力低于環(huán)境壓力，氣鎖中的壓力高于環(huán)境壓力。所述安全工作臺也位于生產(chǎn)室中。
[0016] 在另一個方面，本發(fā)明提供了高純度的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分，其單鏈含量 小于2 · OOwt%。
[0017] 在又一個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含如本文中所述的高純度的肉毒 桿菌毒素神經(jīng)毒性組分和一種或多種可藥用載體。
[0018] 在再一個方面，本發(fā)明提供了如本文中所述的高純度的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組 分用作藥物。
[0019] 在又一個方面，本發(fā)明提供了如本文中所述的高純度的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組 分用于治療與肌肉或外分泌腺的膽堿能神經(jīng)支配活動亢進(jìn)有關(guān)的疾病的治療。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)選實施方式在所附的從屬權(quán)利要求中闡述。
【具體實施方式】
[0021] 意外地發(fā)現(xiàn)，有迄今尚未考慮過但可對肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分的質(zhì)量、特別 是對純度發(fā)揮深刻影響的關(guān)鍵生產(chǎn)參數(shù)。此外，本發(fā)明的生產(chǎn)方法符合與安全、健康和環(huán)境 有關(guān)的法律要求，并奠定了安全和不危險的工作環(huán)境。換句話說，本發(fā)明是基于意外發(fā)現(xiàn)存 在另外的制造過程操作模式，其不僅對于環(huán)境和人體健康問題安全，而且提供了優(yōu)質(zhì)的肉 毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分，特別是優(yōu)質(zhì)。
[0022] 在第一方面，本發(fā)明涉及制備高純度的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分的方法，所述 方法包含以下步驟：
[0023] (a)在允許產(chǎn)生肉毒桿菌毒素的條件下培養(yǎng)肉毒桿菌，和
[0024] (b)從所述肉毒桿菌毒素分離神經(jīng)毒性組分。
[0025] 在本文中使用時，術(shù)語"肉毒桿菌毒素"或"肉毒桿菌毒素復(fù)合體"是可互換的并且 是指包含大約150kDa的神經(jīng)毒性組分以及梭狀芽孢桿菌菌屬的非毒性蛋白質(zhì)、包括血凝素 和非血凝素蛋白質(zhì)的高分子量復(fù)合體。此外，術(shù)語"肉毒桿菌毒素"和"肉毒桿菌毒素復(fù)合 體"意欲涵蓋全部七種毒素血清型（即A、B、C、D、E、F和G血清型）及其亞型（例如，A1，A2，C1， C2,等等）。
[0026] 術(shù)語"神經(jīng)毒性組分"，在本文中使用時，是指肉毒桿菌毒素復(fù)合體中包含的肉毒 桿菌毒素蛋白質(zhì)分子(也稱為"純毒素"或"純神經(jīng)毒素"）。換句話說，本發(fā)明含義內(nèi)的"神經(jīng) 毒性組分"沒有締合并且缺乏任何相關(guān)的肉毒桿菌非毒素蛋白質(zhì)、包括血凝素和非血凝素 蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，它也沒有可能與所述神經(jīng)毒性組分締合的RNA。
[0027]還指出本發(fā)明含義內(nèi)的"神經(jīng)毒性組分"包括大約150kDa的單鏈前體蛋白質(zhì)和蛋 白水解加工的雙鏈形式的神經(jīng)毒性組分，后者包含大約50kDa的輕鏈(LC)和大約lOOkDa的 重鏈(HC)，它們通常由一個或多個二硫鍵連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，只有在蛋白水解活 化之后才能達(dá)到完全的生物活性，即使可以設(shè)想到未加工的前體能夠發(fā)揮一些生物功能。 "生物功能"可以是指(a)受體結(jié)合，（b)內(nèi)化，（c)跨內(nèi)體膜易位到細(xì)胞溶質(zhì)中，和/或(d)參 與突觸小泡膜融合的蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解。
[0028]優(yōu)選地，所述神經(jīng)毒性組分源自于天然存在的43、(：、04、？或6血清型的肉毒桿菌 毒素復(fù)合體。在本發(fā)明的情形內(nèi)，特別優(yōu)選的神經(jīng)毒性組分源自于A血清型肉毒桿菌毒素， 特別是源自于由Hall菌株(ATCC 3502)產(chǎn)生的A型肉毒桿菌毒素。然而，在本發(fā)明的情形內(nèi)， 神經(jīng)毒性組分也可以是重組產(chǎn)生的組分，包括嵌合的（融合的）神經(jīng)毒性組分。還包括含有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多20個氨基酸突變的被遺傳修飾的神經(jīng)毒性組分。突變可以是 取代、插入或缺失。另外，含有化學(xué)修飾的氨基酸、例如一個或多個被糖基化、乙?；?、脂化 或以其它方式修飾的氨基酸的神經(jīng)毒性組分，也包含在術(shù)語"神經(jīng)毒性組分"內(nèi)。
[0029]術(shù)語"高純度神經(jīng)毒性組分"在本發(fā)明的含義