igma公司）
[0116] 乙臘（可購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）
[0117] 似儀器
[0118] 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀MLDI-TOF-MS (型號：REFLEX III，德國 Bruker 公司）；
[0119] 做基質(zhì)液：將曰-CCA溶于含0. 1% TFA的50% ACN溶液中，制成飽和溶液，離心 取上清；
[0120] (4)儀器檢測條件：反射檢測方式；飛行管長3m ;氮激光器：波長337nm，加速電壓 20KV;反射電壓23KV。 陽12U 妨操作步驟：分別取1化上述純化多膚（1)和似的樣品，各自與1化的飽和 基質(zhì)上清液混合等體積混合，分別取1 μL點(diǎn)在樣品祀上，送入離子源中進(jìn)行檢測。
[0122] 結(jié)果，測得所得服Ρ90 α -2抗原表位膚（1)的分子量為2404. 5, HSP90 α -2抗原表 位膚（2)的分子量為2483. 5,與理論分子量2404. 35、2483. 39 -致，證明合成多膚即為目的 產(chǎn)物。 陽12引 2.通過多膚序列測定分別鑒定所得服Ρ90 α -2抗原表位膚（1)和似的序列。
[0124] (1)原理：多膚氨基酸序列分析的基本原理是E血an降解，是一個循環(huán)式的化學(xué)反 應(yīng)過程。包括Ξ個主要的化學(xué)步驟：（1)偶聯(lián)：異硫氯酸苯醋與蛋白質(zhì)和多膚的N-端殘基 反應(yīng)，形成苯氨基硫甲酯（PTC)衍生物，即PTC-膚。（2)環(huán)化裂解：PTC-膚環(huán)化裂解。（3) 轉(zhuǎn)化：嚷挫嶺酬苯氨（AT幻轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）。留在溶液中的減少了 一個氨基酸殘基的膚再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過程，整個測序過程現(xiàn)在都是通過測序儀自動進(jìn) 行。 陽12引 似儀器：美國ABI公司491型蛋白質(zhì)/多膚N-末端氨基酸序列分析儀
[0126] 做試劑原料 陽127] 異硫氯酸苯醋WTC，可購自sigma公司
[012引正庚燒，可購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 陽129] Ξ甲胺TMA水溶液，可購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 陽130] TFA( Ξ氣乙酸，可購自sigma公司） 陽131] 乙酸乙醋，可購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 陽132] 氯下燒，可購自sigma公司 陽133] 乙臘，可購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 陽134] (4)測定 陽135] 按儀器說明書進(jìn)行。
[0136] 結(jié)果：經(jīng)鑒定，所得服Ρ90α-2抗原表位膚（1)和似的序列分別為：
[0137] (l)Y-E-K-E-S-E-D-K-P-E-I-E-D-V-G-S-D-E ;和 陽 1 ；38] (2) Y-R-G-I-D-E-D-D-P-T-A-D-D-T-S-A-A-V-T-E。
[0139] 該結(jié)果與目標(biāo)合成膚段一致。
[0140] 實(shí)施例2 :分別將實(shí)施例1所得的服P90 α -2抗原表位膚（1)和似與載體蛋白 連接W制備HSP90a-2抗原（1)和（2)，利用所得抗原（1)和（2)分別免疫動物，從而利用 抗原（1)制備特異性的單克隆抗體和多克隆抗體，并且利用抗原（2)制備特異性的單克隆 抗體和多克隆抗體。 陽 141] 1.抗原的制備：用抓B 度is-diazotizedbenzidine dichloride)法將服P90 α-2 膚段（1)和似分別與載體蛋白KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白）（得自sigma公司）連接制備成 HSP90 α -2抗原（1)和似。
[0142] 取服Ρ90 α -2膚段（1)或似10.0 mg，用1ml 0. 1Μ PBS緩沖液加7. 4)溶解； KLH lOmg，用0. 2M棚酸鹽緩沖液加9. 0)20ml溶解；然后將兩者混合，冷卻至0°C，取 抓BCWIO化，室溫下反應(yīng)1. 5h，透析過夜后分裝，-20°C保存。 陽143] 在本實(shí)施例中，PBS緩沖液的配方為：0. 2mol/L的Na2HP〇481ml加 0. 2mol/L的 NaHzPOziigml 混合而成。
[0144] 棚酸鹽緩沖液的配方為：0. 05mol/L棚砂80ml，加 0. 2mol/L棚酸20ml混合而成。
[0145] 2.免疫動物制備單克隆抗體： 陽146] 2. 1.取上述制備的HSP90 α -2抗原（1)和（2)(免疫原）分別與等體積的弗氏完 全佐劑（購自上海源聚生物公司）充分混合后，免疫Ba化/c小鼠，50 μ g抗原/只，皮下多 點(diǎn)注射。4周后測血清效價，選擇免疫反應(yīng)性好的小鼠再加強(qiáng)免疫：取抗原與等體積的不完 全弗氏佐劑（購自上海源聚生物公司）充分混合后，抗原劑量25 μ g/只，皮下多點(diǎn)注射，加 強(qiáng)免疫的次數(shù)為6次，每次間隔2-3周，融合前另外連續(xù)加強(qiáng)免疫兩次，每次間隔1-2周，之 后取脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50% PEG(MW4000)(購自中原化工公司）介 導(dǎo)進(jìn)行融合，并用HAT條件培養(yǎng)基（購自sigma公司）選擇培養(yǎng)。融合后放入C〇2培養(yǎng)箱中 37°C培養(yǎng)9~11天后，孔內(nèi)出現(xiàn)較大的細(xì)胞克隆。11天開始用間接化ISA進(jìn)行篩選。對初 篩陽性的孔利用有限稀釋法進(jìn)行4次克隆化培養(yǎng)（即使篩選后的細(xì)胞大量分裂繁殖），之后 擴(kuò)增細(xì)胞、凍存、制備腹水。 陽147] 2. 2.將Ba化/c小鼠用降植燒（購自sigma公司）0. 5ml/只處理，一周后腹腔接種 雜交瘤細(xì)胞2 X 1〇6個/只，10天后收集腹水。
[0148] 2. 3.測定抗體效價：用間接化ISA方法測定利用HSP90 α -2抗原（1)制備的單克 隆抗體（1)的效價，結(jié)果顯示單抗的效價達(dá)到1:32000 W上。
[0149] 利用HSP90 α -2抗原（2)制備的單克隆抗體（2)的效價也利用相同的方法進(jìn)行測 定，其效價也達(dá)到1:32000 W上。 陽150] 3.免疫動物制備多克隆抗體： 陽151] 3. 1.選用Ξ個月齡、體重約為2kg左右的新西蘭白兔作為免疫動物?；A(chǔ)免疫中， 將l-2mg上述制備的HSP90 α -2抗原（1)和（2)(免疫原）分別與等體積的完全弗氏佐劑 (購自上海源聚生物公司）混合-充分乳化后在兔子背部進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射。每隔4周加 強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫6次，抗原與不完全弗氏佐劑（購自上海源聚生物公司）充分乳化 后，W 100 μ g/只于背部多點(diǎn)皮下注射。末次加強(qiáng)免疫后第10天頸動脈放血，分離血清。 陽15引 3. 2.測定抗體效價：用間接ELISA法測定利用服P90 α -2抗原（1)制備的多克隆 抗體（1)的效價，結(jié)果顯示抗體效價達(dá)到1:32000 W上。 陽153] 利用HSP90 α -2抗原（2)制備的多克隆抗體（2)的效價也利用相同的方法進(jìn)行測 定，其效價也達(dá)到1:32000 W上。 陽154] 3. 3.取血及分離血清：頸動脈插管取血，分離血清。 陽1巧]4.分離純化抗體：硫酸錠沉淀后，再經(jīng)Protein G(購自sigma公司）親和純化。 陽156] 5.抗體分裝后凍干，低溫保存。 陽157] 實(shí)施例3 :人服P90 α -2單克隆抗體（1)和似的特異性鑒定
[0158] W化ISA進(jìn)行檢測。分別W人服Ρ90α -2蛋白、S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性締醇 化酶NSE (均購自上海聯(lián)碩公司）為檢測抗原包被化ISA板，通過化ISA分別檢測所制備的 HSP90 α -2單克隆抗體（1)和（2)與該人服P90 α -2蛋白的特異性反應(yīng)，W正常BALB/c小 鼠血清作陰性對照，PBS液作空白對照。
[0159] 結(jié)果：服P90 α -2單克隆抗體（1)和似分別只與服P90 α -2反應(yīng)為陽性 (Ρ/Ν〉2. 1)，而與S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性締醇化酶NSE反應(yīng)為陰性，說明本發(fā)明的 HSP90a-2單克隆抗體（1)和（2)分別具有特異性。 陽160] 實(shí)施例4 :人服P90 α -2多克隆抗體（1)和似的特異性鑒定 陽161] 利用與上述鑒定單克隆抗體特異性相同的方法進(jìn)行鑒定。
[0162] 結(jié)果顯示：服Ρ90 α -2多克隆抗體（1)和似分別與服Ρ90 α -2反應(yīng)為陽性 (Ρ/Ν〉2. 1)，而與S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性締醇化酶NSE反應(yīng)為陰性，說明本發(fā)明的 HSP90a -2多克隆抗體（1)和（2)分別具有特異性。
[0163] 實(shí)施例5 :利用服P90 α -2單克隆抗體和服P