一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌及其作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株枯草芽抱桿菌及其應(yīng)用，主要應(yīng)用于植物病害的生物防治方面， 該枯草芽抱桿菌可W用于括抗魔芋軟腐病、水稻白葉枯病。
【背景技術(shù)】
[0002] 軟腐病俗稱"半邊瘋"，是魔芋生產(chǎn)上危害最嚴重的病害。魔芋軟腐病屬軟腐歐文 氏菌屬（Erwinia)，是一種革蘭氏陰性細菌，胡蘿h軟腐歐氏桿菌胡蘿l·軟腐亞種 化1'訊；[]11日。日1'01：0￥0^3山339.。日1'01：0￥0^)，栽培期及膽藏期可發(fā)病，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。魔芋 種植業(yè)每年因軟腐病損失巨大。
[0003] 水稻白葉枯病又稱白葉攝、茅草攝、地火燒等是水稻主要病害病原菌為水稻白葉 枯黃單胞桿菌(Xanthomanas oryzae pv.oryzal Dye),屬黃單胞桿菌屬細菌。主要特征為 病株葉尖及邊緣初生黃綠色斑點，后沿葉脈發(fā)展成蒼白色、黃褐色長條斑，最后變灰白色而 枯死，造成釉谷和碎米，導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收，對產(chǎn)量影響較大。
[0004] 幾個世紀W來，化學(xué)農(nóng)藥在植物病蟲害的防治中發(fā)揮了巨大作用，為農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)、 穩(wěn)產(chǎn)和提高品質(zhì)做出了重要貢獻。但是由于過量施用和濫用農(nóng)藥導(dǎo)致地力衰退和環(huán)境污 染。尤其近幾年來由于農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴重影響了人們的生活質(zhì)量。在當(dāng)前農(nóng)作物無公害栽 培中，微生物農(nóng)藥越來越受到重視。因為它們不僅防治病蟲害的效果好，而且對環(huán)境友好、 對農(nóng)作物無污染，病蟲對其不易產(chǎn)生抗藥性。因此，在生物農(nóng)藥中，W微生物農(nóng)藥用途多、應(yīng) 用前景最為廣闊。
[0005] 芽抱桿菌屬的細菌為好氧或兼性厭氧的桿菌，廣泛分布在水、空氣和±壤中。芽抱 桿菌在抱子狀態(tài)下穩(wěn)定性好，能耐氧化;耐擠壓;耐高溫，能長期耐60°C高溫，在120°C溫度 下能存活20分鐘；耐酸堿，在酸性胃環(huán)境中能保持活性，可W耐唾液和膽汁的攻擊，是飼料 微生物中可100%直達大小腸的活菌。同時本品具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少 抗生素藥物的使用，增強免疫力的優(yōu)點，因而在生物防止病蟲害中起著重要作用。目前芽抱 桿菌屬用于防止病蟲害主要有:枯草芽抱桿菌、臘狀芽抱桿菌、短小芽抱桿菌等。
[0006] 本發(fā)明從疏花水柏枝(Myricaria Laxiflora)的健康的葉中分離得到一株內(nèi)生枯 草芽抱桿菌，它對魔芋軟腐病原菌和水稻白葉枯病原菌有很好的抑制作用，為開發(fā)新的植 物生防制劑提供技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一是提供一種枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl菌株，該枯 草芽抱桿菌對魔芋軟腐病原、水稻白葉枯病原有很好的抑制作用，為開發(fā)新的生物農(nóng)藥品 種、植物生物防治菌劑提供了新選擇。
[000引所述枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl是從疏花水柏枝中獲得的，于2014年 5月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號為CCTCCN0: M2014182，保藏地址為中國， 武漢，武漢大學(xué)。
[0009] 本發(fā)明枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl在LB培養(yǎng)基上具有w下微生物學(xué) 特性:菌落近圓形、表面光滑，污白色，菌體桿狀，單生或成短鏈，革蘭氏陰性，具芽抱。
[0010] 本發(fā)明目的是提供一種用于生物防治植物病害的菌劑和生物農(nóng)藥，其活性成分為 枯草芽抱桿菌MSI或其發(fā)酵液。其中所述植物病害為魔芋軟腐病、水稻白葉枯病。抑菌試驗 表明，枯草芽抱桿菌MSI對魔芋軟腐病、水稻白葉枯病原菌具有抑制效果。故可將菌株的發(fā) 酵液或菌懸液作為農(nóng)藥的有效成分用于植物病害的生物防治，或者將本菌株制備成菌劑用 于植物病害的生物防治。因而，本發(fā)明還包括含有所述菌株或者其發(fā)酵液的生物農(nóng)藥，W及 含有所述菌株的微生物菌劑。
[0011] 所述的枯草芽抱桿菌發(fā)酵液，制備方法如下：
[0012] 1)菌種活化:取保存于-86°C冰箱的枯草芽抱桿菌菌株菌種接種于LB液體培養(yǎng)基 中，30°C下，200rpm振蕩培養(yǎng)12小時，作為種子培養(yǎng)液；
[0013] 2)菌株發(fā)酵：將上述種子液W5%(V/V)濃度接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C下， 20化pm振蕩培養(yǎng)18小時，獲得發(fā)酵液，離屯、獲得上清液，即為發(fā)酵液。
[0014] 本發(fā)明W枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl單菌落為模板，使用通用上游引 物27f:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和通用下游引物1492r:5'-GGTTACCTTGTTT ACG ACT T-3'進行菌落PCR擴增獲得lOOObp的16srDNA部分序列（SEQ ID N0:1)。通過Blast 與GenBank收錄的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)MSI與枯草芽抱桿菌的同源性為99%。用MEGA4.1進化 樹（圖），鑒定菌株(MSI)與一株枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilisKJ469796)的同源性達 97%。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl的菌落形態(tài)。
[0016] 圖2為本發(fā)明的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl的顯微形態(tài)。
[0017] 圖3為本發(fā)明的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl發(fā)酵液對水稻白葉枯病原 菌括抗作用效果。
[0018] 圖4為本發(fā)明的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl發(fā)酵液對魔芋軟腐病病原 菌括抗作用效果。
[0019] 圖5為本發(fā)明的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育 樹。
【具體實施方式】
[0020] 實施例一:枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl的分離和保存
[0021] 2012年在Ξ峽流域湖北宜昌境內(nèi)姻脂巧采集疏花水柏枝葉片，采用稀釋平板法從 中獲得細菌；
[0022] 制備稀釋液:取疏花水柏枝葉lOg，加入lOOmL無菌水中，將組織研磨搗碎。無菌操 作吸取搗碎組織液1. OmL加入9.0血無菌水中，在用無菌水稀釋為1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、 ΙΟΛΙΟ-7共7個濃度梯度。
[0023] 培養(yǎng):取各濃度梯度稀釋液10化L分別涂布于LB培養(yǎng)基平板(蛋白腺lOg/L，酵母膏 5g/L，NaCl 1 Og/L，瓊脂15g/L，其余為水，pH7.2-7.4，12 rC滅菌20min)中，倒置恒溫箱內(nèi)30 °c培養(yǎng)。
[0024] 取單菌落:待平板上長出菌落后，根據(jù)形態(tài)挑取單菌落于lOmL滅菌的LB液體培養(yǎng) 基(蛋白腺1 Og/