L，酵母膏5g/L，化C1 lOg/L，其余為水，pH7.2-7.4，12rC滅菌20min)中，恒 溫30°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí);得到細(xì)菌培養(yǎng)液。
[0025] 采用甘油保藏法，在滅菌的菌種管中，加入l.OmL細(xì)菌培養(yǎng)液，0.5ml 50% (體積濃 度）的甘油，混勻后于-86 °C冰箱保存。
[0026] 將該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、;保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué);保 藏日期:2014年5月5日，保藏編號(hào)為CCTCCN0:M2014182。
[0027] 實(shí)施例二:枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl鑒定 [00%]菌株的形態(tài)特征形態(tài)特征見(jiàn)圖1。
[0029] 菌株的顯微形態(tài)特征見(jiàn)圖2。
[0030] 16S rDNA序列分析:采用通用引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增16S rDNA序列。上游引物27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物 1492r:5'-GGT TAC CTT GTTT ACG ACT T-3'。反 應(yīng)體系如下：
[0031]
[0032] 反應(yīng)條件：94。(：預(yù)變性5111111，94。(：變性1111111，55。(：退火1111111，72。(：延伸9〇3,33個(gè)循 環(huán)，最后72°C延伸SmiruPCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑取1500bp左右的條帶進(jìn)行凝 膠回收，送上海生工測(cè)序。
[0033] 將測(cè)得的序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，并選取同源性較高的菌株的序列用 MEGA4.1軟件構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0034] 實(shí)施例枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl發(fā)酵液的制備
[0035] 菌種活化:取保存-86°C冰箱的枯草芽抱桿菌菌株菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 °C下，200rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，作為種子培養(yǎng)液。
[0036] 菌株發(fā)酵:將上述種子液W5% (V/V)濃度接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C下，200rpm 振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，獲得發(fā)酵液，離屯、獲得發(fā)酵液上清液。
[0037] 實(shí)施例四：枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl發(fā)酵液對(duì)水稻葉白枯病原菌括 抗作用
[0038] 濾紙片法檢測(cè)發(fā)酵液的對(duì)水稻葉白枯病原菌抑菌活性。將水稻葉白枯病原菌接種 LB斜面，37 °C培養(yǎng)24小時(shí)，加入2mL無(wú)菌水制成菌懸液，取ImL菌懸液加入100m化B固體培養(yǎng) 基(45°C左右)混勻，倒入培養(yǎng)皿，在無(wú)菌條件下取出各2(Κ)化發(fā)酵液、無(wú)菌水和氨節(jié)青霉素 (濃度為50yg/mL)滴加于直徑10mm的無(wú)菌濾紙，用無(wú)菌綴子在每個(gè)培養(yǎng)皿放四個(gè)濾紙片，無(wú) 菌水為空白對(duì)照，氨節(jié)青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)酵液設(shè)置兩個(gè)平行，每個(gè)平板做3個(gè)重復(fù)，放入 培養(yǎng)箱恒溫倒置37Γ培養(yǎng)2地。觀察抑菌作用，測(cè)量抑菌圈直徑大小。
[0039] 結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0040] 實(shí)施例五:枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl發(fā)酵液對(duì)魔芋軟腐病原菌括抗 作用
[0041] 濾紙片法檢測(cè)發(fā)酵液的對(duì)魔芋軟腐病原菌抑菌活性。將魔芋軟腐病原菌接種LB斜 面，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，加入2mL無(wú)菌水制成菌懸液，取ImL菌懸液加入lOOmL LB固體培養(yǎng)基 (45°C左右)混勻，倒入培養(yǎng)皿，在無(wú)菌條件下取出各20化L發(fā)酵液、無(wú)菌水和氨節(jié)青霉素(濃 度為50yg/mL)滴加于直徑10mm的無(wú)菌濾紙，用無(wú)菌綴子在每個(gè)培養(yǎng)皿放四個(gè)濾紙片，無(wú)菌 水為空白對(duì)照，氨節(jié)青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)酵液設(shè)置兩個(gè)平行，每個(gè)平板做3個(gè)重復(fù)，放入培 養(yǎng)箱恒溫倒置37°C培養(yǎng)2地。觀察抑菌作用，測(cè)量抑菌圈直徑大小。
[0042] 結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0043] 序列表
[0044] _
[0045] 序列表
[0046] SEQ ID N0：1
[0047]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MSl，于2014年5月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2014182,保藏地址為湖北，武漢，武漢大學(xué)。2. -種生物防治植物病害的菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌或其發(fā)酵液。3. 權(quán)利要求2所述的生物防治植物病害的菌劑在防治魔芋軟腐病或水稻白葉枯病上的 應(yīng)用。4. 一種生物農(nóng)藥，其含有權(quán)利要求1的枯草芽孢桿菌或其發(fā)酵液或權(quán)利要求2所述的菌 劑。5. 權(quán)利要求4所述的生物農(nóng)藥在拮抗魔芋軟腐病上的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求4所述的生物農(nóng)藥在防治水稻白葉枯病病原菌上的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌、權(quán)利要求2所述的菌劑或權(quán)利要求4所述的生物農(nóng) 藥在植物病害生物防治中的應(yīng)用，其中所述的植物病害是魔芋軟腐病、水稻白葉枯病。8. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備生物農(nóng)藥中的應(yīng)用， 其中所述的生物農(nóng)藥抑制魔芋軟腐病、水稻白葉枯病。9. 權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，其特征在于，制備方法如下： 1) 菌種活化:取保存于-86 °C冰箱的枯草芽孢桿菌菌株菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 °C下，200rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，作為種子培養(yǎng)液； 2) 菌株發(fā)酵:將上述種子液以5%(V/V)濃度接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C下，200rpm振 蕩培養(yǎng)18小時(shí)，獲得發(fā)酵液，離心獲得上清液，即為發(fā)酵液。10. 權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的枯草芽孢桿菌是從疏花水柏枝的根中獲得的內(nèi)生真菌。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。該枯草芽孢桿菌保藏名稱為<i>Bacillus？subtilis？</i>MS1；保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)；保藏日期：2014年5月5日，保藏編號(hào)為CCTCC？NO：M？2014182。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該內(nèi)生枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)植物病害魔芋軟腐病、水稻白葉枯病病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，可用于制備防治魔芋軟腐病、水稻白葉枯病的生物菌劑，為開(kāi)發(fā)新的生物農(nóng)藥品種、植物生物防治菌劑提供了新選擇，具有一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。CCTCC NO：M 201418220140505
【IPC分類】A01N63/00, A01N63/02, A01P1/00, C12N1/20, C12R1/125
【公開(kāi)號(hào)】CN105670954
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】劉士平, 蔣維, 孔玉珊, 秦王閣閣, 李淵韜, 薛艷紅, 高媛
【申請(qǐng)人】三峽大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年1月20日