一種兩性離子型聚合物微球及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分離和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種兩性離子型聚合物微球 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫檢測技術(shù)是一種基于抗原和抗體特異性作用的生化檢測方法，其發(fā)展來源于 19世紀(jì)50年代發(fā)明的免疫比濁檢測技術(shù)。免疫比濁檢測可W利用抗原抗體反應(yīng)后形成的 沉淀或濁度來進(jìn)行直接測定，但在臨床檢驗(yàn)中，某些待測物在標(biāo)本中的含量很低（甚至只 有納克級(jí)別）。因此為了尋找增加敏感度的方法，將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定 的物質(zhì)加 W標(biāo)記，通過測定標(biāo)記物來提高敏感度。相繼出現(xiàn)的標(biāo)記免疫分析技術(shù)如：酶免疫 檢測、化學(xué)發(fā)光免疫檢測和巧光免疫檢測等技術(shù)，其標(biāo)記物分別為酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和巧光 物質(zhì)，運(yùn)樣靈敏度可W提高數(shù)百至數(shù)千倍，檢測下限可W到達(dá)納克級(jí)別。由于抗體抗原之間 特異性的作用，免疫檢測常應(yīng)用于復(fù)雜體系中某中物質(zhì)的檢測，相比傳統(tǒng)的化學(xué)檢測方法， 更加快捷，準(zhǔn)確。
[0003] 酶免疫檢測可分為均相和非均相兩種類型。均相酶免反應(yīng)中游離的和結(jié)合的標(biāo)記 物的分離比較困難，一般在不分離的情況下直接測定標(biāo)記物，所W均相酶免疫檢的誤差可 能會(huì)比較大，在臨床檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。非均相EIA則利用了固相載體，可W對游離的和結(jié)合 的標(biāo)記物進(jìn)行分離，運(yùn)樣檢測的時(shí)候干擾就會(huì)比較小。但非均相酶免疫檢測由于其操作上 的復(fù)雜性阻礙了酶免疫檢測的發(fā)展和應(yīng)用。
[0004] 近年來，隨著納米科技的高速發(fā)展，其在醫(yī)藥、能源、環(huán)境、生物技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng) 用越來越廣泛。納米材料的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)使得納米材料具有區(qū)別于宏觀材料所獨(dú) 特的性質(zhì)。具中W聚合物納米微球?yàn)槔?，一方面由于表面具有豐富的可修飾基團(tuán)，便于與抗 體，蛋白質(zhì)，W及祀向配體的結(jié)合，另一方面作為固相載體，聚合物納米微球的某些獨(dú)特性 質(zhì)對于免疫反應(yīng)的信號(hào)放大、便于分離清洗W及在機(jī)器上實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化起到了突出作用， 其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用十分具有代表性。 陽〇化]例如膠乳增強(qiáng)免疫比濁法利用粒徑均勻的聚合物膠乳顆粒作為固相載體，使其吸 附特異性抗體，制成免疫性微球后，與傳統(tǒng)免疫比濁法相比，解決了當(dāng)檢測少量的抗原抗體 時(shí)，其復(fù)合物極難形成濁度變化的問題。運(yùn)是因?yàn)楫?dāng)結(jié)合了抗體的微球與抗原發(fā)生免疫反 應(yīng)時(shí)，不溶性抗原抗體復(fù)合物快速在膠乳表面形成，由于聚合物膠乳復(fù)合物的粒徑要比單 純抗原抗體復(fù)合物的粒徑大得多，在可見光范圍內(nèi)，比對反應(yīng)前后的溶液濁度變化，既吸光 度的變化。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法增強(qiáng)了免疫反應(yīng)的反應(yīng)信號(hào)，其吸光度的變化在一定范圍 內(nèi)和被測物的含量成正比，由此可計(jì)算被測物含量。
[0006] 再如化學(xué)發(fā)光免疫檢測的原理是利用小分子叮晚醋等標(biāo)記物的氧化還原反應(yīng)，發(fā) 射的光子被光信號(hào)計(jì)量裝置接收后，進(jìn)行數(shù)字處理，計(jì)算出標(biāo)記物的相應(yīng)發(fā)光值。而運(yùn)一檢 測系統(tǒng)中的關(guān)鍵組分一-聚合物磁性微球承載了免疫反應(yīng)固相載體的作用W及快速分離 的重要作用。首先抗體結(jié)合在聚合物磁性微球上，由于免疫反應(yīng)的高特異性，將待檢測物從 待檢測樣本復(fù)雜的物質(zhì)構(gòu)成中分離捕獲出來，當(dāng)加入帶有標(biāo)記物的二抗時(shí)，在磁性微球上 形成兩株抗體夾待測物運(yùn)一復(fù)合物形式，同時(shí)由于微球的超順磁性，在外加磁場下可快速 分離，W去除溶液中游離的帶有標(biāo)記物的二抗，從而構(gòu)建出待測物質(zhì)和標(biāo)記物的關(guān)系，也將 具體數(shù)字化的發(fā)光值與待測物含量聯(lián)系起來。
[0007] 最后巧光增強(qiáng)免疫層析是近年來出現(xiàn)的一種新型檢測方法，其方法是巧光（包括 稀±整合物、有機(jī)巧光染料等）聚合物微球上定向偶聯(lián)抗體片段，通過毛細(xì)作用，樣本中的 抗原與巧光微球表面抗體結(jié)合后，從而帶動(dòng)繼續(xù)在膜上延展，在檢測線附近與固定的二抗 形成巧光微球-抗體-抗原-二抗復(fù)合物，直接檢測巧光微球的巧光，從而確定待測物中抗 原的含量。要求巧光微球可W免受一般溶劑的干擾，巧光發(fā)射強(qiáng)而穩(wěn)定，巧光微球標(biāo)記的抗 體在干燥溶解后仍然可W保持其巧光活性、生物活性和單分散的膠體狀態(tài)。巧光微球由于 可W實(shí)現(xiàn)很高的F/P值，對于實(shí)現(xiàn)高靈敏的巧光免疫分析提供了很好的應(yīng)用前景。
[0008] W上=種方法均采用的聚合物微球通常是非常疏水的材料，直接應(yīng)用會(huì)不可避免 存在蛋白質(zhì)在材料表面吸附的問題，非特異性的蛋白吸附會(huì)造成試劑聚集，增加反映的本 底值，導(dǎo)致反應(yīng)基線的波動(dòng)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)斐杉訇栃曰蛘呒訇幮缘慕Y(jié)果，直接影響到檢測 的可信度，形成誤診或者漏診等危害。因此，降低聚合物微球試劑非特異性吸附的研究越來 越受到重視。提高膠乳微球試劑的穩(wěn)定性，W防止其聚集，降低其非特異性吸附并減少其在 血清或者全血中與樣品組分的非特異性互相作用，是如今體外診斷測定中的一個(gè)挑戰(zhàn)。
[0009] 疏水相互作用和靜電場被認(rèn)為是非特異性吸附的兩大起因。疏水相互作用是通 過疏水物的非極性疏水基與水相互排斥作用而發(fā)生的。運(yùn)種作用使疏水基相互靠猶，當(dāng)?shù)?白質(zhì)分子與聚合物基質(zhì)的作用時(shí)，會(huì)影響蛋白質(zhì)的=維結(jié)構(gòu)，使其變得結(jié)構(gòu)松散，導(dǎo)致蛋白 質(zhì)在基質(zhì)表面發(fā)生構(gòu)型的延展，甚至失活。靜電場的原理可W簡單描述為"同性相斥，異性 相吸"，因此靜電場對吸附的作用取決于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、體系的抑和聚合物表面的電荷情 況。另外聚合物表面也可W與雜質(zhì)發(fā)生非特異性的覆蓋結(jié)合，運(yùn)也是非特異性吸附的重要 起因。
[0010] 兩性離子聚合物是帶有等量正負(fù)電荷的聚合物，兩性離子聚合物通過離子溶劑化 作用，與水分子具有更強(qiáng)的結(jié)合能力。W細(xì)胞膜為例，其主要成分是憐脂類雙親性分子，在 水溶液中，細(xì)胞膜可W有效保持細(xì)胞表面形成一層緊密的結(jié)合水，并不與雜蛋白結(jié)合。憐酸 膽堿是組成細(xì)胞膜的基本單元的親水基端，是細(xì)胞外層膜中的最外層基團(tuán)，具有電中性、高 親水性、無毒和在生理抑值下穩(wěn)定的特性。常見的兩性離子聚合物單體有2-甲基丙締酷 氧基憐酸膽堿（MPC)、橫酸基甜菜堿和簇酸基甜菜堿等，使用運(yùn)類物質(zhì)修飾材料后，由于熱 力學(xué)作用使雙親性分子的疏水尾部與水的作用最小，親水基團(tuán)最大限度地暴露出來與水接 觸，從而可W形成一層類似膜結(jié)構(gòu)。同時(shí)，由于它們都是是電中性的，在一個(gè)給定的結(jié)構(gòu)中 正電荷和負(fù)電荷平衡，導(dǎo)致材料表面由于靜電場的吸附也減少。將兩性離子通過共聚引入 疏水性的聚合物微球上W改善其親水性和降低其非特異性結(jié)合的方法在現(xiàn)在技術(shù)中還沒 有被報(bào)道過。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種兩性離子型聚合物微球及其 制備方法，將兩性離子通過共聚引入疏水性的聚合物微球上W改善其親水性和降低其非特 異性結(jié)合，同時(shí)在此基礎(chǔ)上引入長鏈官能團(tuán)分子，通過化學(xué)鍵偶聯(lián)分子探針，一方面共價(jià)結(jié) 合使得的復(fù)合物更加穩(wěn)定，同時(shí)長鏈的官能團(tuán)可W減少偶聯(lián)時(shí)空間位阻，穩(wěn)定結(jié)合的生物 分子活性。
[0012] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種兩性離子型聚合物微球，包括載體和固載在載體 上的功能性配基，所述載體為疏水性聚合物微球，其中，所述載體上還固載有兩性離子基 團(tuán)，所述兩性離子基團(tuán)同時(shí)含有陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)。
[0013] 優(yōu)選地，所述陽離于基團(tuán)為胺基鹽離子、季錠或化晚陽離子等，所述陰離子基團(tuán)為 簇酸基、橫酸基、憐酸基或硫酸醋基等。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述兩性離子基團(tuán)為憐酸基類兩性離子單體、橫酸基類兩性離子 單體和簇酸基類兩性離子單體中的一種或多種。
[0015] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述兩性離子基團(tuán)為2-甲基丙締酷氧乙基憐酸膽堿、橫酸基甜 菜堿（例如N，N-二甲基-N-甲基丙締酷胺基丙基-N-丙烷橫酸內(nèi)鹽）和簇酸基甜菜堿（例 如N，N-二甲基-N-甲基丙締酷氧乙基-N-乙酸內(nèi)鹽）。
[0016] 優(yōu)選地，所述功能性配基為具有間隔臂的官能團(tuán)單體。一方面引入的官能團(tuán)結(jié)構(gòu) 為共價(jià)結(jié)合提供活性位點(diǎn)，官能團(tuán)種類和含量可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，另一方面其長鏈 結(jié)構(gòu)可避免兩性離子型憐酸膽堿單體對官能基團(tuán)的遮蔽，減少偶聯(lián)時(shí)的空間位阻，為抗體 抗原的結(jié)合提供了有利條件。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述功能性配基為帶有簇基的長鏈聚合物單體，例如帶有徑基的 聚合物單體（如甲基丙締酸徑乙醋，甲基丙締酸聚乙二醇單醋等）與帶有酸酢的分子（如 馬來酸酢，下二酸酢等）反應(yīng)，徑基與酸酢形成醋鍵后，再裸露出另一分子的簇基，再通過 共聚引入到聚合物微球結(jié)構(gòu)中。
[0018] 優(yōu)選地，載體上功能性配基的有效載入量為100~1000 y mol/g