技術(shù)選育納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513時，選育平 板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分（芒果汁），而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定比例的選育平 板組分（豆芽汁），使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，促使選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的 菌株在發(fā)酵時依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。
[0045] 步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：① 制備2個平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個將甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量為10-15mg/ L)，為平板C，另一個為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D)，為平板D;②將誘變后的干酪乳 桿菌（LactobacilluscaseiShirota)涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個 平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落 而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營 養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Mef，保藏于斜面MRS固體培養(yǎng)基中。
[0046] 所述的平板MRS固體培養(yǎng)基和斜面MRS固體培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組 成：
[0047] 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g;
[0048] 酵母膏 5.0g; 貯檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量；
[0049]該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
[0050]該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌的篩選。
[0051] 本發(fā)明中，采用隨機誘變技術(shù)獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Me〇的干酪乳桿 菌（LactobacilluscaseiShirota-Meif，LcS-Met〇。LcS-Meif在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-513,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，通過構(gòu)建共生關(guān) 系的策略實現(xiàn)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵，獲得富含NK和PQQ的芒果汁。
[0052] 步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將BN-NKPQQ-RWX-513和LcS-Met_*別進行活化培 養(yǎng)，BN-NKPQQ-RWX-513在豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34? 36°C(優(yōu)選35°C)，LcS-Met_在MRS液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38°C(優(yōu) 選 37。。）。
[0053] 所述的豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組成：
[0054]芒果汁 100 ?150mL;
[0055]鹿糖 4. 0 ?6. 0g;
[0056] 豆芽汁 余量。
[0057] 所述的豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基以1L計，優(yōu)選的，由以下量的組分組成：
[0058]芒果汁 100 ?150mL;
[0059]鹿糖 5.0g;
[0060] 豆芽汁 余量。
[0061] 該豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至1000mL后過濾，得到豆芽汁。
[0062] 所述的MRS液體培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組成：
[0063] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 豐寧檬酸氫二鞍 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量；
[0064] 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
[0065] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[0066] 將BN-NKPQQ-RWX-513和LcS-Met_*發(fā)酵含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體包括：將活 化后的BN-NKPQQ-RWX-513和LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含芒果汁的 發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含NK和PQQ的芒果汁。
[0067] 所述的含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組成：
[0068] 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 豆芽汁 lOOmL; 芒果汁 余量。
[0069] 所述的芒果汁的制備包括：水中加去皮的芒果果肉，碾磨成漿汁。具體地如100mL 水中加10?25g去皮的芒果果肉，碾磨成漿汁。
[0070] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-513和LcS-Mef的混合密度比為1:2?1:5。
[0071] 所述的混合菌液接種至含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1%?5%。
[0072] 所述的紗布封口培養(yǎng)的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養(yǎng)24h?36h。
[0073] 共發(fā)酵時，在含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加酪氨酸和谷氨酸對 BN-NKPQQ-RWX-513進行代謝調(diào)控，促進PQQ合成，添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-513進行代 謝調(diào)控，促進NK生成，添加豆芽汁促進BN-NKPQQ-RWX-513在芒果汁發(fā)酵過程中的增殖。本 發(fā)明中，納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備的發(fā)酵芒果汁富含納豆激酶和吡 咯喹啉醌，具有芒果汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0074] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0075] -、本發(fā)明使用的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級安全微生物。
[0076] 二、首次采用基因組重排技術(shù)優(yōu)化NK和PQQ合成途徑，對納豆芽孢桿菌所有可能 與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實現(xiàn)多位點協(xié)同突變，進而通過高通量 篩選使多位點協(xié)同突變的表型從突變庫中凸顯。同時，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進一步采 用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時依然表現(xiàn)出高產(chǎn) 表型，獲得能夠在芒果汁發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513。
[0077] 三、首次采用構(gòu)建共生關(guān)系的策略實現(xiàn)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵。通 過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Met_)干酪乳桿菌LcS_Met_。LcS_Met_在生長速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-513,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā) 酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的芒果汁。
[0078] 四、從結(jié)構(gòu)上看，PQQ通過酪氨酸和谷氨酸之間形成肽鍵連接環(huán)化而成。本發(fā)明通 過在含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪氨酸和谷氨酸對BN-NKPQQ-RWX-513進行代謝調(diào)控， 促進PQQ合成。通過在含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-513進行代 謝調(diào)控，促進NK生成。通過在含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆芽汁促進BN-NKPQQ-RWX-513 在芒果汁發(fā)酵過程中的增殖，從而得到富含NK和PQQ的芒果汁，PQQ含量達(dá)到61-90ng/mL。 NK活力達(dá)到330-685U/mL。所獲得的芒果汁富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有芒果汁固有 的滋味和氣味?！揪唧w實施方式】
[0079] 在實施例中，有關(guān)培養(yǎng)基配制如下，
[0080] (a)所述的豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計，由以 下量的組分組成：
[0081]芒果汁 130mL;
[0082]鹿糖 5.0g;
[0083] 豆芽汁 余量；
[0084] 該豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至1000mL后過濾，得到豆芽汁。
[0085] (b)所述的豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L 計，由以下量的組分組成：
[0086] 儼果訃 130mL； 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0087] 該豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基（平板）的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通 量篩選。
[0088] (c)所述的豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L 計，由以下量的組分組成：
[0089] HI- 130mL； 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量； 倒試管斜面
[0090] 該豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基（斜面）的配方有利于納豆芽孢桿菌的保藏。
[0091] ⑷所述的MRS液體培養(yǎng)基配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計，由以下量的組 分組成：
[0092] 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g;
[0093] 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH6.2 ?6.4
[0094] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。