[0095] (e)所述的MRS固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計(jì)，由以 下量的組分組成：
[0096] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 豐寧檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH6.2 ?6.4
[0097] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和篩選。
[0098] (f)所述的MRS固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計(jì)，由以 下量的組分組成：
[0099] 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g;
[0100] 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酉交猛 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH6.2 ?6.4 倒試管斜面
[0101] 該MRS固體培養(yǎng)基（斜面）有利于干酪乳桿菌保藏。
[0102] (g)所述的含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成：
[0103] 鹿糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 立芽訃 lOOmL； 芒果汁 余量。
[0104] (h)所述的芒果汁的制備包括：1000mL水中加200g去皮的芒果果肉，碾磨成漿汁。
[0105] 本發(fā)明實(shí)施例中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆 芽孢桿菌10261來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區(qū)酒仙 橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10261 ;納豆芽孢桿菌10263 來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院 6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10263 ;干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei Shirota)來自養(yǎng)樂多（上海）有限公司；小鼠抗PQQIgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購 自嘉興元科生物科技有限公司，商品號(hào)為YK-Ab-013。
[0106] 實(shí)施例1
[0107] 本發(fā)明通過納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的芒 果汁，包括以下步驟：
[0108] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513的選育
[0109] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513,具體方法為：首先構(gòu)建納豆芽孢桿菌突變庫，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合（促融劑為聚乙二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽孢 桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生 長旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。
[0110] 突變庫高通量篩選：①制備2個(gè)豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基平板（芒果汁占平板總 量的10-15 %，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQIgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砭€，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 孢桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-513,保藏于豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0111] ⑵甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Me〇的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0112] 將干酪乳桿菌（LactobacilluscaseiShirota)進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型（LcS-MeO。
[0113] LcS-Metl帝選：①制備2個(gè)MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個(gè)為單純MRS平板（平板D);②將干酪乳桿菌 (LactobacilluscaseiShirota)的誘變后代涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至 另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出 現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落甲硫氨 酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為LcS-Mef，保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0114] (3)BN-NKPQQ-RWX-513 的活化培養(yǎng)
[0115] 將保存于豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-513取一環(huán)，接種 至豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到109cfu/mL左右。
[0116] (4)LcS-Met-的活化培養(yǎng)
[0117] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS_Met_取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37°C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到109cfu/mL左右。
[0118] (5)富含NK和PQQ的芒果汁的發(fā)酵制備
[0119] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-513與LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:2 (1X108CFM/mL: 2X108CFM/mL)，混合菌液以1 %接種量接種含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基， 42°C六層紗布封口培養(yǎng)24h，得到富含NK和PQQ的芒果汁。含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-513合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽 汁有利于納豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過肽鍵連 接環(huán)化而成。發(fā)酵結(jié)束后，芒果汁中NK活力330U/mL，PQQ含量61ng/mL。所獲得的芒果汁 富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有芒果汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0120] 實(shí)施例2
[0121] 本發(fā)明通過納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的芒 果汁，包括以下步驟：
[0122] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513的選育
[0123] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513,具體方法為：首先構(gòu)建納豆芽孢桿菌突變庫，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)融合（促融劑為聚乙二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽 孢桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且 生長旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。
[0124] 突變庫高通量篩選：①制備2個(gè)豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基平板（芒果汁占平板總 量的10-15 %，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQIgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砭€，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大小；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 孢桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-513,保藏于豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0125] (2)甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Me〇的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0126] 將干酪乳桿菌（LactobacilluscaseiShirota)進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型（LcS-MeO。
[0127]LcS-Mett帝選：①制備2個(gè)MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D);②將干 酪乳桿菌（LactobacilluscaseiShirota)的誘變后代涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素 膜影印至