另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置， 平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌 落甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為L(zhǎng)cS-Mef，保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0128] (3)BN-NKPQQ-RWX-513 的活化培養(yǎng)
[0129] 將保存于豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-513取一環(huán)，接種 至豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到109cfu/mL左右。
[0130] (4)LcS-Mef的活化培養(yǎng)
[0131] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS-Met_取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37°C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到109cfu/mL左右。
[0132] (5)富含NK和PQQ的芒果汁的發(fā)酵制備
[0133] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-513與LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:5 (1X108CFM/mL: 5X108CFM/mL)，混合菌液以5 %接種量接種含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基， 37°C六層紗布封口培養(yǎng)36h，得到富含NK和PQQ的芒果汁。含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-513合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽 汁有利于納豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過(guò)肽鍵連 接環(huán)化而成。發(fā)酵結(jié)束后，芒果汁中NK活力685U/mL，PQQ含量90ng/mL。所獲得的芒果汁 富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有芒果汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0134] 本發(fā)明中采用色譜法測(cè)定PQQ，具體步驟參照"NojiN,NakamuraT，Kitahata N,etal.Simpleandsensitivemethodforpyrroloquinolinequinone(PQQ)analysis invariousfoodsusingliquidchromatography/electrospray-lonizationtandem massspectrometry.JAgriFoodChem，2007, 55 (18): 7258-7263.'，〇
[0135] 本發(fā)明中采用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測(cè)定NK活力。測(cè)定步驟：將發(fā)酵液過(guò)濾 后點(diǎn)種在瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37°C孵育18h，以尿激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)測(cè)量透明圈 直徑計(jì)算納豆激酶相當(dāng)于尿激酶的活力單位（U/mL)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其特征在于，包括以下 步驟： 1) 、將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進(jìn) 行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，高通量篩選得到高產(chǎn)納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513 ; 2) 、將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌， 命名為干酪乳桿菌LcS-Met_; 3) 將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵芒果汁，得到富 含納豆激酶和吡咯喹啉醌的芒果汁。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其特 征在于，步驟1)中，所述的高通量篩選具體包括：①制備2個(gè)平板豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng) 基，其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖維蛋白 配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计?中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板 A中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌的誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢?jiàn)沉淀圈，根據(jù)沉淀圈直徑大小 可肉眼判斷產(chǎn)吡咯喹啉醌量大??；④平板B中，高產(chǎn)納豆激酶的誘變?nèi)诤虾蟠渲車?成透明圈，根據(jù)透明圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高 產(chǎn)吡咯喹啉醌菌落與高產(chǎn)納豆激酶菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌 的納豆芽孢桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其特 征在于，步驟1)中，所述的平板豆芽汁芒果汁固體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： ?、1.:采汁 100?150mL; 鹿糖 4.0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其特 征在于，步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：①制 備2個(gè)平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個(gè)將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個(gè)為單純MRS固體培 養(yǎng)基平板，為平板D ;②將誘變后的干酪乳桿菌涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至 另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出 現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫 氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其特 征在于，步驟2)中，所述的平板MRS固體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 豐寧檬酸氫二銨 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其 特征在于，步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513和干酪乳桿菌 LcS-Met_分別進(jìn)行活化培養(yǎng)，納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513在豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基 中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34?36 °C，干酪乳桿菌MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活 化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38 °C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其特 征在于，步驟3)中，所述的豆芽汁芒果汁液體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 芒果汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁余量； 所述的MRS液體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2..0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g： 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其特 征在于，步驟3)中，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵芒果 汁，具體包括：將活化后的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-513和干酪乳桿菌LcS-Met_混合， 形成混合菌液，將混合菌液接種至含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含納豆 激酶和吡咯喹啉醌的芒果汁。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其特 征在于，步驟3)中，所述的含芒果汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 鹿糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; Λ7:芽?Ι· IOOmL; 芒果汁 余量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，其 特征在于，步驟3)中，所述的芒果汁的制備包括：水中加去皮的芒果果肉，碾磨成漿汁。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵芒果汁的制作方法，包括：將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變，然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，并在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌共發(fā)酵芒果汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的芒果汁。本發(fā)明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的芒果汁中，吡咯喹啉醌含量達(dá)到61-90ng/mL，納豆激酶活力達(dá)到330-685U/mL。
【IPC分類】C12R1-07, C12R1-245, A23L1-29, C12N15-01, C12N15-03, A23L2-02
【公開號(hào)】CN104522773
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410751622
【發(fā)明人】張哲滔, 鄧惟, 阮子琦, 吳淵, 莫凡
【申請(qǐng)人】杭州元佩特生物科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月10日