冷凝隔室下方的皮膚區(qū)域進(jìn)行取樣 并冷卻。將得自樣品的皮膚切片用Hemalun-曙紅染色。圖10中的結(jié)果顯示在x200放大 倍數(shù)的顯微鏡下看到的觀測結(jié)果。
[0126] 結(jié)果表明，施用具有包含OVA的冷凝隔室的皮膚給藥裝置，誘導(dǎo)表皮變厚，這在施 用24小時(shí)后可見，并且在施用48小時(shí)后顯著。
[0127] 實(shí)施例11
[0128] 誘導(dǎo)抗原進(jìn)入皮膚以及其由樹突狀細(xì)胞進(jìn)行的處理，與具有冷凝隔室的裝置的皮 膚施用時(shí)間的延長成比例。
[0129] -按照實(shí)施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但是其具有包含干形式的 0VA(100yg/cm2)偶聯(lián) Alexa 488(A488)的 10mm3/cm2體積施用于雌性 BALB/c 小鼠 （η = 10-20)的后背6、24或48小時(shí)，小鼠后背在施用前一天經(jīng)過剃毛和脫毛。將冷凝隔室下的 皮膚區(qū)域取樣。在從真皮分離表皮后（0.5%胰蛋白酶），通過機(jī)械再懸浮分離表皮細(xì)胞并 通過酶消化（膠原酶/DNA酶）真皮細(xì)胞。在細(xì)胞懸液中和在樹突狀細(xì)胞中檢測OVA-A 488, 所述細(xì)胞通過通過流式細(xì)胞術(shù)（FACscallibur and Cell quest軟件）使用⑶Ilc標(biāo)志進(jìn) 行識別。圖11中示出的結(jié)果用在每種細(xì)胞懸液（表皮和真皮）的總細(xì)胞中和樹突狀細(xì)胞 (CDllc +)中的熒光細(xì)胞（OVA-A488+)的百分?jǐn)?shù)表示。
[0130] 結(jié)果表明一些表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞是OVA-A488+,并且它們的比例隨著具有含 OVA-A488的冷凝隔室的皮膚給藥裝置的施用時(shí)間延長而增加。這些OVA-A 488+細(xì)胞中的一 部分是樹突狀細(xì)胞（CDllc+)并且類似地，樹突狀OVA-A 488+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)隨著包括冷凝隔室 的皮膚給藥裝置的施用時(shí)間的延長而增加。
[0131] -按照實(shí)施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但是其具有包含干形式的 OVA (100 μ g/cm2)偶聯(lián) Alexa 488 (A488)的 10mm3/cm2體積，將其施用于豬（n = 1)的后背 24 小時(shí)，豬后背在施用前一天經(jīng)過剃毛和脫毛。
[0132] 對冷凝隔室下方的皮膚區(qū)域進(jìn)行取樣。在從真皮分離表皮后（0. 5%胰蛋白酶）， 通過機(jī)械再懸浮分離表皮細(xì)胞并通過酶消化（膠原酶/DNA酶）真皮細(xì)胞。在細(xì)胞懸液中和 在樹突狀細(xì)胞中檢測OVA-A488，所述細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)（FACscallibur and Cell quest 軟件）使用SLA-II標(biāo)志進(jìn)行識別。圖11中示出的結(jié)果用在每種細(xì)胞懸液（表皮和真皮） 的總細(xì)胞中和樹突狀細(xì)胞（SLA-ΙΓ)中的熒光細(xì)胞（OVA-A 488+)的百分?jǐn)?shù)表示。
[0133] 結(jié)果表明在施用具有含OVA-A488的冷凝隔室的皮膚給藥裝置24小時(shí)之后，一些表 皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞是〇VA-A 488+。這些OVA-A488+細(xì)胞的一部分是樹突狀細(xì)胞（SLA-π+)。
[0134] 圖11中示出的結(jié)果表明包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置促進(jìn)了抗原進(jìn)入皮膚，并 且促進(jìn)其被樹突狀細(xì)胞的處理。
[0135] 實(shí)施例12
[0136] 表皮郎格罕氏細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中被誘導(dǎo)的變化，其與具有冷凝隔室的裝置的皮膚施用時(shí) 間的延長成比例。
[0137] 按照實(shí)施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但其具有包含干形式的 OVA(K)O μ g)的10mm3/cm2體積，將其施用于雌性BALB/c小鼠 （η = 5)的后背0、24或48 小時(shí)，小鼠后背在施用前一天經(jīng)過剃毛和脫毛。對冷凝隔室下方的皮膚區(qū)域進(jìn)行取樣并 冷凍。用CD207標(biāo)志從得自樣品的皮膚切片上識別郎格罕氏細(xì)胞。圖12中的結(jié)果表明在 χ200放大倍數(shù)的顯微鏡檢術(shù)下得到的觀測結(jié)果。
[0138] 結(jié)果表明，施用具有含OVA的冷凝隔室的皮膚給藥裝置誘導(dǎo)表皮郎格罕氏細(xì)胞網(wǎng) 絡(luò)的變化，這在施用24小時(shí)之后可見，在施用48小時(shí)之后顯著。這一現(xiàn)象是這些細(xì)胞活化 的特征。
[0139] 實(shí)施例13
[0140] 誘導(dǎo)產(chǎn)生對腫瘤抗原特異的抗體，所述抗體能夠在將具有含腫瘤抗原的冷凝隔室 的裝置施用于皮膚24小時(shí)時(shí)間之后，在體外靶定表達(dá)該抗原的細(xì)胞。
[0141] 按照實(shí)施例1制備了包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但其具有包含干形式的腫瘤 抗原的l〇mm 3/cm2體積，將其施用于雌性BALB/c小鼠 （η = 6)的后背24小時(shí)，小鼠后背在 施用前一天經(jīng)過剃毛和脫毛。在首次施用之后2和4周重新施用。對在最后一次施用之后 2周取樣的動物血清進(jìn)行的ELISA，測試抗-抗原總IgG類型抗體。動物的血清與表達(dá)該腫 瘤抗原的細(xì)胞溫育。通過流式細(xì)胞術(shù)（FACscallibur and Cell quest軟件），用熒光小鼠 抗Ig抗體標(biāo)記之后，檢測在細(xì)胞上固定的腫瘤抗-抗原抗體。圖13中的結(jié)果以顯示與細(xì) 胞數(shù)目有關(guān)的熒光強(qiáng)度的矩形圖形式給出。
[0142] 結(jié)果表明使用具有含腫瘤抗原的冷凝隔室的皮膚給藥裝置，經(jīng)由表皮途徑進(jìn)行免 疫的小鼠血清中所含的腫瘤抗-抗原抗體，表現(xiàn)出體外識別表達(dá)所述腫瘤抗原的細(xì)胞。
[0143] 實(shí)施例14
[0144] 在將具有含RSV抗原的冷凝隔室的裝置施用于皮膚48小時(shí)之后，在幼年小鼠中誘 導(dǎo)的抗呼吸道合胞病毒（RSV)感染的部分防護(hù)。
[0145] 按照實(shí)施例1制備了包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但其具有包含干形式的呼吸 道合胞病毒抗原的IOmmVcm 2體積，將其施用于幼年BALB/c小鼠（7日齡）的后背48小時(shí)。 經(jīng)由鼻內(nèi)途徑與佐劑共同給藥的抗原作為對照。病毒測試在經(jīng)鼻途徑接種之后第23天進(jìn) 行。病毒RNAs的測試在感染之后第5天取樣的肺上進(jìn)行。圖14中示出的結(jié)果用肺中與參 比基因相比較的相對量的病毒RNA表示，并相對于陽性對照（未接種個(gè)體）進(jìn)行歸一化。
[0146] 結(jié)果表明在幼年小鼠中的病毒載量，在具有含RSV抗原的冷凝隔室的裝置皮膚施 用48小時(shí)之后，與未經(jīng)處理的幼年小鼠相比，減低了一半。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 包含抗原制劑的皮膚裝置用于通過誘導(dǎo)對所述抗原特異的免疫應(yīng)答對哺乳動物接 種的應(yīng)用，其中： 所述抗原制劑為干形式并且不含佐劑， 所述皮膚裝置是非穿刺裝置，所述裝置的表面為0. 2到5cm2，當(dāng)在哺乳動物的皮膚上施 用時(shí)，形成體積為2到100mm3/cm2裝置表面且高度為0. 02到Imm的冷凝隔室，以及 所述裝置包含20yg到300yg/cm2裝置表面的量的所述抗原制劑， 以及其中接種包括在哺乳動物的皮膚上至少三次連續(xù)施用這種裝置，每次施用在哺乳 動物的完好無損的皮膚上進(jìn)行，不含佐劑，歷時(shí)6到72小時(shí)，所述反復(fù)施用導(dǎo)致誘導(dǎo)對所述 抗原特異的免疫應(yīng)答。
2. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述至少三次施用的每次施用間隔7到30天。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中，對于每次施用，所述裝置被保持在皮膚上歷時(shí)6到48小 時(shí)。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中，對于每次施用，所述裝置被保持在皮膚上歷時(shí)48小時(shí)。
5.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其包括至少三次連續(xù)施用所述裝置歷時(shí)48小時(shí)，每次施用間隔 15天。
6. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗原制劑是粉末形式，并且通過靜電力或通過范德華 力被保持在所述裝置的表面上。
7.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗原的分子量是至少500道爾頓。
8.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗原的分子量是至少1500道爾頓。
9.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗原是細(xì)菌抗原，病毒抗原，腫瘤抗原，或牽涉身免疫 疾病的抗原。
10.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗原是分子量大于1500道爾頓的多肽或蛋白質(zhì)。
11. 權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述抗原是腫瘤蛋白質(zhì)。
12. 權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述抗原是毒素。
13.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述抗原是病毒蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述哺乳動物是人。
【專利摘要】本發(fā)明涉及皮膚免疫用方法和組合物，具體地涉及開發(fā)經(jīng)由皮膚途徑遞送疫苗的系統(tǒng)，更具體地涉及包含冷凝隔室的裝置在表皮接種中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及允許在無任何皮膚處理的條件下即可獲得有效免疫應(yīng)答的表皮接種方案。本發(fā)明可以在任何哺乳動物、優(yōu)選在人類中實(shí)施，以誘導(dǎo)對抗任何類型的抗原的治療性或預(yù)防性免疫應(yīng)答。
【IPC分類】A61K39-00, A61P37-02, A61K9-70
【公開號】CN104721815
【申請?zhí)枴緾N201510087956
【發(fā)明人】約爾格·龍科, 西爾維·戈德弗魯瓦, 貝特朗·杜邦
【申請人】Dbv技術(shù)公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2008年12月3日
【公告號】CA2706363A1, CN101883560A, EP2217222A1, US8968743, US20100310596, WO2009080933A1