施用特殊膳食(至約160天齡)。由Dyets Inc.(Bethlehem, PA)配制并提供膳食，所述膳食基于改良的AIN-93G膳食。隨意飼喂這些膳食。到達后2周，在約80天齡，切去動物的卵巢，允許其恢復3周，然后對其施用限定的膳食。在第一研宄中，這些膳食含有0,0.08,0.48,3.2、18.5、185或3700 μ g/kg/天的WS 二氫氯化物(圖2)。在第二次隨訪研宄中，膳食不含WS (對照)、包含草酸匪S (18.5或55.5g/kg/d)、或包含提供等效劑量的匪S-葡糖苷的量的碾磨的Zanthoxylum種子(18.5或55.5g/kg/d ;圖8)。使用帶有質譜檢測的液相色譜證實WS和WS-葡糖苷的含量。提取方法類似于Yanase等人，2010的那些。
[0068]在第一行為評估(開放場地)之前，持續(xù)2周飼喂所有膳食。正對照動物接受填充有晶體狀17 β -雌二醇和膽固醇混合物的5.0mm皮下硅橡膠膠囊植入物(25%，內徑0.058英寸，內徑0.077英寸；Dow Corning#508-006)。然后檢驗動物的運動活性(開放場地)并在間隔兩周的兩個行為試驗(高架十字迷宮和游泳試驗)中評估情緒。最終行為任務(游泳試驗)后2周，麻醉動物并檢驗它們對實驗誘導的熱潮紅的生理反應。溫度監(jiān)測完成后，收獲組織，同時動物仍然被麻醉。
[0069]卵巢切除術。到達后2周，通過吸入異氟醚麻醉每只動物，剃去背部中腰區(qū)域的毛并利用外科擦洗液(scrub)、碘和醇擦洗。然后，將動物放置在覆蓋有無菌布/墊的溫熱墊上，腹部躺臥且尾巴朝向外科醫(yī)生。在胸腔的尾部邊緣和尾巴的基部中間開2-3cm的背部中線皮膚切口。在右側和左側脊髓和腹部中線之間距離約1/3處在肌肉壁內開5.5-10mm長的單個橫切口。穿過肌肉壁從腹內去除卵巢和輸卵管。將止血鉗夾在輸卵管和子宮之間的子宮脈管系統(tǒng)周圍并用可溶解的縫合線結扎子宮脈管系統(tǒng)。利用穿過卵巢附近的輸卵管的單切口，移除每個卵巢和部分輸卵管。移除止血鉗并將剩余組織放回腹膜腔中。以類似方式移除另一側的卵巢。不縫合肌肉切口。使用無菌創(chuàng)傷夾使皮膚傷口閉合。每天監(jiān)測動物的感染跡象或發(fā)病。
[0070]動物處理。在行為分析之前，持續(xù)4天每天處理大鼠。這包含:將動物從其籠子中溫和地移出，并保持它在實驗者膝部的毛巾上無拘無束，從而允許動物探索。這使動物適應實驗者的處理。所有行為試驗發(fā)生在鄰近聚居(colony)室的房間，在試驗之前使動物過夜適應試驗室。
[0071]開放場地任務。在開放場地檢驗動物以測量總體運動活性和基礎焦慮狀態(tài)。在開放場地試驗中，將每只大鼠放在由測量為100X100X40cm的場地組成的新環(huán)境中。將大鼠放置在室(chamber)中部并用數(shù)碼相機記錄開放場地行為持續(xù)30分鐘并通過軟件(AnyMaze, Stoelting C0., Inc)測量。分析下述參數(shù):a)總行進距離；b)在中心的時間；c)中心進入；和d)排泄糞便的次數(shù)。
[0072]高架十字迷宮任務。在高架十字迷宮上檢驗動物以測量焦慮相關行為。將十字迷宮升高至超過地板?85cm，其由具有相同尺寸(50X10cm)的2個開放臂和2個閉合臂組成。閉合臂被40cm高的壁包圍，臂由黑色丙稀酸厚片構成，其從中心平臺(1XlOcm)發(fā)散以形成十字(Lafayette Instruments, Lafayette, IN)。將每只大鼠放置在中心平臺中并面對開放臂中的一個，然后用視頻捕獲軟件(AnyMaze)在5分鐘的試驗期期間記錄其行為。利用視頻分析(AnyMaze)評估在開放和閉合臂上的時間量和進入開放和閉合臂的次數(shù)。此夕卜，實驗者還通過花費在后腿站起(rearing)、修飾(grooming)上的時間，和出現(xiàn)伸展姿勢(stretch-attend posture)的次數(shù)和頭越過開放臂的邊緣的次數(shù)對動物實時評分。
[0073]游泳試驗。在游泳試驗中檢驗每只大鼠的抑郁狀行為。在連續(xù)2天內進行該試驗，因為它是對感知到的無法逃脫處境的適應性反應的測量。第一個試驗為使動物意識到這是無法逃脫處境，第二個試驗測量動物的消極應對程度，其源自不愿意保持在無法逃脫處境中努力。典型的抗抑郁劑限制消極應對(不動性)的量并提高積極應對(游泳/攀爬)的量。在第一天(0800h-1300h)，通過下述方法使動物適應試驗:將它們放置在填充30cm新鮮水(25°C)的有機玻璃圓柱狀容器(45cmX20cm)中持續(xù)15分鐘，然后用毛巾干燥它們并使其返回它們的居住籠中。在第二天(24小時后)，如下進行試驗:總游泳時間為5分鐘，然后用毛巾干燥大鼠并使其返回它們的居住籠中。通過固定在圓柱體上方的天花板上并與筆記本電腦相連的數(shù)碼攝像機記錄這兩個試驗。通過行為軟件(Anymaze, Stoelting C0.)實時測量花費在游泳和不動上的總時間，并由遠離捕獲視頻的盲實驗者在事后評分。游泳被定義為:不破壞水面的前肢和后肢的運動。不動性被定義為:缺乏除了動物保持其頭部在水之上所需的輕微運動之外的任何運動。攀爬被定義為:破壞水面的前肢快速運動。
[0074]熱潮紅研宄。利用腹膜內共注射尿烷(750mg/kg)和α -氯醛糖(60mg/kg)來麻醉動物。這種麻醉是優(yōu)選的，因為它通常不導致與利用異氟烷、戊巴比妥或氯胺酮/甲苯噻嗪時觀察到的相同程度的體溫過低。此外，異氟烷已顯示出抑制CGRP誘導的熱潮紅。將熱敏電阻器探針(ADI Instruments, Colorado Springs, CO)綁在一只后足的足底面。40分鐘后，在麻醉誘導的體溫過低已穩(wěn)定后，記錄基礎皮膚溫度。然后，在實驗的剩余部分期間，以5秒的間隔監(jiān)測溫度。然后，通過尾靜脈注射溶解在鹽水中的降鈣素基因相關肽(CGRP;10 μ g/kg, 1.V.)。由于儀器通量的限制，同時最多檢測8只動物?；\伴(cage mate)總是一起檢測以避免單房(single-housing)壓力和潛在的壓力激素對體溫的影響。因此，在任何一個給定的日內，僅能檢測4組。這導致10個8只動物的群組(cohort)[每天一個8只動物的集合，持續(xù)2周(10個工作日)]以及一些處理組缺乏日內對照。這種一些組缺乏日內對照隨后對熱潮紅反應的最終分析造成干擾，因此將這些組從熱潮紅分析中除去。
[0075]結果
[0076]如圖1-11中所詳述:
[0077]A)來自碾磨的Zanthoxylum種子的匪S-葡糖苷以類似于雌激素(即，雌二醇)和化學合成匪S的方式減弱了熱潮紅反應。
[0078]B) Zanthoxylum種子不影響總體重量增加、子宮生長或情緒相關行為。這些發(fā)現(xiàn)類似于利用化學合成NMS的那些。
[0079]C)當使用計算人等效劑量(HED)的體表面積(BSA)法時，NMS關于體溫調節(jié)效應的HED為約150-840 μ g/d。數(shù)據(jù)表明:優(yōu)化給定產品中的匪S含量能夠提供絕經期熱潮紅的減輕而無子宮生長相關的風險。
[0080]D)在隨訪研宄中，碾磨的日本辣椒種子中的匪S-葡糖苷等效于化學合成匪S，且當使用 BSA 計算時，其 HED = 150-540 μ g/d(0.7-3.2g 種子 /d)。
[0081]E)匪S使非子宮雌二醇分泌增至3倍，這可解釋來自Zanthoxylum種子的匪S-葡糖苷的一些效應。
【主權項】
1.有效量的η-甲基5-羥色胺葡糖苷(“WS-葡糖苷”)或WS-前體在預防或改善絕經期相關熱潮紅中的用途。2.根據(jù)權利要求1的用途，其中WS-葡糖苷或WS-前體存在于植物來源。3.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中所述植物來源是Zanthoxylumpiperitum種子或Zanthoxylum piperitum 種子提取物。4.根據(jù)權利要求1-3中任一項的用途，其中所述Zanthoxylumpiperitum種子是成熟種子。5.根據(jù)權利要求1-4中任一項的用途，其中匪S-葡糖苷存在于食品補充劑或營養(yǎng)品中。6.根據(jù)權利要求1-5中任一項的用途，其中還使用η-甲基5-羥色胺(“匪S”)。7.減少絕經期熱潮紅的頻率或減輕絕經期熱潮紅的嚴重性的方法，其包括:向有此需要的女性施用有效量的WS-葡糖苷或WS-前體或它們的混合物。8.根據(jù)權利要求7的方法，其中所述匪S-葡糖苷來自植物來源。9.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述NMS-葡糖苷存在于Zanthoxylumpiperitum種子或Zanthoxylum piperitum種子提取物中。10.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述Zanthoxylumpiperitum種子是成熟種子。11.根據(jù)權利要求7的方法，其中匪S-葡糖苷存在于食品補充劑或營養(yǎng)品中。12.根據(jù)權利要求7的方法，其中還施用匪S。13.天然地含有匪S-葡糖苷或匪S的植物的提取物，其已被標準化為含有有效量的WS-葡糖苷或WS以使其減少絕經期相關熱潮紅的發(fā)生。14.包含匪S-葡糖苷的食品補充劑或營養(yǎng)品。15.根據(jù)權利要求14的食品補充劑，其還包含匪S。
【專利摘要】Zanthoxylum piperitum(通常被稱為日本辣椒)種子(包括其成熟種子)含有NMS前體/V-甲基5-羥色胺5-O-β-葡糖苷(“NMS-葡糖苷”)，其以充足的濃度存在并以充足的效率被代謝以提供有效量的NMS用于改善絕經期癥狀，包括熱潮紅/潮熱。日本辣椒種子或日本辣椒種子提取物還可被用于富化NMS或NMS前體的其它來源以提供用于控制熱潮紅的營養(yǎng)品或食品補充劑。
【IPC分類】A61K36/758, A61P15/12
【公開號】CN104936604
【申請?zhí)枴緾N201480005801
【發(fā)明人】克里斯托弗·邁克爾·巴特, 邁克爾·韋澤
【申請人】帝斯曼知識產權資產管理有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2014年1月24日
【公告號】EP2948159A1, US20140213536, US20150320783, WO2014115113A1