電子天平、數(shù)顯游標(biāo)卡尺（精密度0.0 lmm)、微量注射器（50 μ I)、C02培養(yǎng)箱、恒溫 水浴箱、離心機(jī)、連續(xù)光譜酶標(biāo)儀、顯微鏡、玻片架、200目篩網(wǎng)、手術(shù)器械、秒表、一次性定量 取血管、24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0076] SRBC、補(bǔ)體（豚鼠血清）、Hanks液、SA緩沖液、瓊脂糖、印度墨汁、Na2CO3溶液、都 氏試劑、YAC-I細(xì)胞、RPMI1640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰、INT、PMS、NAD、0. 2mol/LTris-HCl緩沖 液、1 % NP40、ConA、1 %冰醋酸、MTT液、酸性異丙醇、lmol/L HCl溶液、PBS溶液、Giemsa染 液。
[0077] 1. 5實(shí)驗(yàn)方法：
[0078] 1. 5. 1遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH)(足趾增厚法）
[0079] 小鼠腹腔注射2% (V/V)SRBC，致敏后4天測(cè)量左后足跖部厚度，然后在測(cè)量部位 皮下注射體積分?jǐn)?shù)為20%的SRBC (20 μ 1/每鼠），注射后24h測(cè)量左后足跖部厚度，同一部 位測(cè)量3次，取平均值。以注射前后足跖厚度的差值，表示DTH的程度。
[0080] I. 5. 2ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT)法
[0081] 無(wú)菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用Hanks液洗2次，每次離心10min(1000r/min)，將細(xì) 胞懸浮于Iml RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液分兩孔 加入24孔培養(yǎng)板中，每孔lml，一孔加75 μ I ConA液（相當(dāng)于7. 5 μ g/ml)，另一孔作為對(duì) 照，置5% CO2，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔吸取上清液0. 7ml，加入0. 7ml 不含小牛血清的培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT (5mg/ml) 50 μ 1/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔 加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。在570nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。以加 ConA 孔的OD值減去不加 ConA孔的OD值表示淋巴細(xì)胞繁殖能力。
[0082] 1. 5. 3小鼠臟器/體重比值及血清溶血素測(cè)定
[0083] 小鼠腹腔注射SRBC五天后，摘眼球取血，離心取血清稀釋150倍，進(jìn)行半數(shù)溶血值 測(cè)定。然后處死動(dòng)物，取胸腺、脾臟稱(chēng)重，計(jì)算臟器/體重比值。同時(shí)制備脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行 抗體生成細(xì)胞測(cè)定。
[0084] 1. 5. 4抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良玻片法）
[0085] 取脾，制成細(xì)胞懸液。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后與等量雙倍Hanks液混合，分裝小 試管，每管0. 5ml，再向管內(nèi)加50μ1 10% SRBC(v/v，用SA液配制）、25μ1脾細(xì)胞懸液，迅 速混勻后，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在玻片架上， 放入CO 2培養(yǎng)箱培育1.5h，然后用SA液稀釋的補(bǔ)體（1:8)加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育 I. 5h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。
[0086] 1.5. 5小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)
[0087] 小鼠尾靜脈注射1:3稀釋的印度墨汁，待墨汁注入立即計(jì)時(shí)，注入墨汁2、10min， 分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μ 1，并將其加到2ml Na2CO3溶液中，在600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值 (OD)。將小鼠處死，取肝和脾臟稱(chēng)重，計(jì)算吞噬指數(shù)。
[0088] 吞噬指數(shù) a =結(jié)束體重 XK"V(肝重 + 脾重）K = (log0Dl-log0D2V(t2-tl)
[0089] 上式中0D1、0D2為不同時(shí)間所取血樣的光密度值，tl、t2為取兩血樣的時(shí)間差。
[0090] 1. 5. 6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
[0091 ] 小鼠腹腔注射20 %的雞紅細(xì)胞懸液Iml，間隔0. 5h處死小鼠，固定于鼠板上剪開(kāi) 腹壁皮膚，注射生理鹽水2ml，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板lmin，吸出腹腔洗液Iml，分滴于2片玻片上，37°C溫 育30min，用生理鹽水漂洗，晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，Giemsa染液染色10分鐘，用蒸 餾水漂洗晾干，用油鏡鏡檢，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。
[0092] 吞噬百分率％ =吞噬雞血細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)X 100
[0093] 吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)
[0094] I. 7NK細(xì)胞活性測(cè)定
[0095] 實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng) 液調(diào)整細(xì)胞濃度為4X IO5個(gè)/ml。小鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用Hanks 液洗2次，每次離心10min (1000r/min)。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0. 5ml滅菌水裂解紅細(xì) 胞，20秒后再加入0. 5ml 2倍Hanks液及8ml Hanks液，離心10min(1000r/min)，用Iml含小 牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1 %冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X IO7個(gè) /ml。將靶細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μ 1，實(shí)驗(yàn)孔加入100 μ 1脾細(xì)胞（效靶比50:1)， 自然釋放孔加入1〇〇μ1培養(yǎng)液，最大釋放孔加入1〇〇μ11% NP40,37°C培養(yǎng)4h，離心，取上 清100 μ 1置96孔酶標(biāo)板中，加入LDH基質(zhì)液100 μ 1，反應(yīng)3min，以lmol/L的HCl終止反 應(yīng)，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定OD值。
[0096] NK細(xì)胞活性％ =(反應(yīng)孔OD-自然釋放孔0D)八最大釋放孔00-自然釋放孔 0D)X100
[0097] 1. 6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，再用多個(gè)實(shí)驗(yàn) 組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較法（Dunnett檢驗(yàn)法）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0098] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0099] 2. 1樣品對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響 [0100] 表1.樣品對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響
[0102] 由表1可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠的足趾腫脹度與對(duì)照組比較均有顯著性差異（P < 0· 05、P < 0· 01、P < 0· 01)
[0103] 2. 2樣品對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的影響
[0104] 表2.樣品對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的影響
[0105]
[0106] 由表2可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組比較均無(wú)顯著 性差異（P > 0. 05)
[0107] 2. 3樣品對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響
[0108] 表3.樣品對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響
[0110] 由表3可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠的脾臟/體重比值和胸腺/體重比值與對(duì)照組 比較均無(wú)顯著性差異（P > 0. 05)
[0111] 2. 4樣品對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響
[0112] 表4.樣品對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響
[0114] 由表1可見(jiàn)，中、高劑量組小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較均有顯著性差異 (P < 0.0 UP < 0. 05)
[0115] 2. 5樣品對(duì)小鼠血清溶血素的影響
[0116] 表5.樣品對(duì)小鼠血清溶血素的影響
[0117]
[0118] 由表5可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠的血清溶血素水平與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差 異（P > 0· 05)
[0119] 2. 6樣品對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力的影響
[0120] 表6.樣品對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力的影響
[0122] 由表6可見(jiàn)，低、中劑量組小鼠的單核-巨噬細(xì)胞碳廓清吞噬指數(shù)與對(duì)照組比較均 有顯著性差異（P < 〇· 01、P < 〇· 05)
[0123] 2. 7樣品對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響
[0124] 表7.樣品對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響
[0126] 由表7可見(jiàn)，低、中劑量組小鼠的腹腔吞噬細(xì)胞吞噬百分率與對(duì)照組比較均有顯 著性差異（P < 0. 05、p < 0. 01)。低、中、高劑量組小鼠的腹腔吞噬細(xì)胞吞噬指數(shù)與對(duì)照組 比較均有極顯著性差異（P < 0. 01)
[0127] 2. 8樣品對(duì)小鼠 NK細(xì)胞活性的影響
[0128] 表8樣品對(duì)小鼠 NK細(xì)胞活性的影響
[0129]
[0130] 由表8可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠的NK細(xì)胞