增強干細胞治療潛能的組合物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細胞組合物和方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 干細胞療法是骨髓、皮膚、心臟、角膜移植、移植物抗宿主病、肝腎衰竭、肺損傷、類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫病例如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化、狼瘡和糖尿病治 療；心血管醫(yī)藥、神經(jīng)性疾病和同種異體移植物排斥預(yù)防中的理想方法。
[0004] 可從不同組織，例如骨髓、骨骼肌、牙髓、骨骼、臍帶和脂肪組織分離間充質(zhì)干細胞 (MSC)和/或祖細胞或前體細胞。作為再生藥物中治療方法的可能來源，MSC正引起越來越 高的興趣。干細胞能自我更新并能分化成特定細胞類型，或能治療性地用于促進組織再生 的可溶性因子的產(chǎn)生和分泌。具體說，大量自體移植來源的成年干/祖細胞比起胚胎干細 胞（ES)類型來說，在其大量可獲得性、低腫瘤生成性和能避免與ES細胞有關(guān)的倫理爭議上 都更有優(yōu)勢。
[0005] 為了實現(xiàn)有效修復(fù)或再生缺陷或患病器官和組織的能力，供體干/祖細胞應(yīng)當(dāng)具 有理想的治療性能，例如最小化的副作用，能整合入宿主組織，分化成所需的細胞系，旁分 泌效果，調(diào)節(jié)組織重建和激活內(nèi)源性修復(fù)/再生機制。
[0006] MSC已被用于許多嚙齒動物、家兔、狒狒等的臨床前研究，針對骨髓、皮膚、心臟和 角膜移植、移植物抗宿主病、肝腎衰竭、肺損傷、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病和狼 瘡疾病。這些研究的一些早期結(jié)果已經(jīng)引發(fā)了現(xiàn)在正進行中的人類臨床試驗。這些試驗涉 及治療自身免疫病，如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化和1型糖尿??；同種異體移 植排斥的預(yù)防；和增強骨髓和腎移植的存活率；以及頑固性移植物抗宿主病的治療。
[0007] 心血管疾病的患病和引起死亡的主要因素是冠狀和/或外周血管系統(tǒng)中運輸血 液的血管部分或完全堵塞的后果。當(dāng)這些血管部分堵塞時，血液流動不足導(dǎo)致這些血管供 應(yīng)的肌肉組織缺血，從而抑制肌肉收縮和/或其功能。血液流動完全堵塞導(dǎo)致肌肉組織壞 死。
[0008] 外周動脈?。≒AD)影響了八百萬美國人。它是腿部動脈變窄的結(jié)果。PAD的最常 見癥狀是走路時疲勞、抽筋或疼痛。然而，一些PAD患者會喪失行走能力并不得不截肢。
[0009] 在一些患者個體中，血管阻塞部分由天然過程補償，其中形成新血管（通常稱作 "血管生成"的過程）以及小血管擴大（稱為"動脈發(fā)生"）來代替受損血管的功能。這些 新血管能促使耗竭組織的血流恢復(fù)，從而形成圍繞堵塞血管的"天然旁路"。
[0010] 然而，一些血管生成受損的患者不能產(chǎn)生足夠的旁系血管，以充分補償心血管疾 病導(dǎo)致的血流減少。需要治療缺血疾病的新治療方法。
[0011] 各種研究已經(jīng)評估了 MSC在臨床前動物模型中的療效，且顯示了極大的臨床潛 能。然而，仍然存在對于最佳MSC劑量，給藥途徑，和灌注后MSC細胞命運的主要問題。
[0012] 同樣，非常需要優(yōu)化的治療性MSC組合物以及使用這些組合物的方法，以緩解各 種疾病癥狀，特別是血管疾病治療。
[0013] Walker等，Nat Commun?作者手記，2010年可得）一般公開了用非肌肉肌球蛋 白II (匪II)拮抗劑布雷他汀處理人多潛能干細胞（hPS)，例如人胚胎干細胞（hES)和經(jīng) 誘導(dǎo)的多潛能干細胞（hiPS)能增強hPS細胞在克隆密度和懸浮條件下的存活。美國公開 號20100216181公開了用布雷他汀作為存活因子在無血清和飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多 潛能干細胞。通過在旋轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)細胞來增加細胞數(shù)量。公開的PCT申請 W02012062819公開了一種控制細胞與基材結(jié)合的方法，該方法使用布雷他汀作為細胞與其 通常沒有親和力或親和力有限的基材的細胞黏著的促進劑。
[0014] 然而，這些文獻都沒有教導(dǎo)或提示當(dāng)用含干細胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗劑治 療患者時觀察到出乎意料的較好結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的一個方面涉及一種治療血管疾病的方法，包括向有需要的患者給予有效 量的含有一群細胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗劑的組合物，從而治療該血管疾病。
[0016] 在一個實施方式中，血管疾病是糖尿病的結(jié)果。在另一個實施方式中，血管疾病是 動脈粥樣硬化的結(jié)果。在另一個實施方式中，血管疾病是外周血管疾?。≒VD)。在還有一個 實施方式中，血管疾病是外周動脈疾?。≒AD)。在還有一個實施方式中，血管疾病與約或小 于〇. 9的踝肱壓力指數(shù)相關(guān)。在還有一個實施方式中，血管疾病與約或小于0. 7的踝肱壓 力指數(shù)相關(guān)。在還有另一個實施方式中，血管疾病導(dǎo)致重癥肢體缺血。在另一個實施方式 中，血管疾病導(dǎo)致皮膚潰瘍或壞疽。在另一個實施方式中，組合物導(dǎo)致或增強血管生成。在 還有另一個實施方式中，組合物導(dǎo)致或增強血管生成，其與對照相比增加至少約20%。
[0017] 在還有一個實施方式中，一群細胞的一部分包含多潛能細胞（pluripotent cell)。在還有另一個實施方式中，多潛能細胞是經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細胞。在還有一個實施 方式中，一群細胞的一部分包含多能細胞（multipotent cell)。在還有另一個實施方式中， 多能細胞是多能間充質(zhì)細胞或間充質(zhì)干細胞。在還有另一個實施方式中，多能細胞衍生自 經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細胞。在還有其他實施方式中，該組合物包含藥學(xué)上可接受的運載體。
[0018] 在另一個實施方式中，與同一未接受該組合物的患者相比，患者的肢體功能增強 了約或至少2-3級。在另一個實施方式中，患者的肢體血流提高到正常或未治療的肢體血 流的約或至少65-85%。在另一個實施方式中，與同一未接受該組合物的患者相比，患者的 缺血損傷改善了約或至少2、3、或4級。在另一個實施方式中，與同一未接受該組合物的患 者相比，患者的缺血損傷以更快的速度（或以加速）改善。
[0019] 在還有一個實施方式中，靜脈內(nèi)給予組合物。在還有一個實施方式中，肌肉內(nèi)給予 組合物。在另一個實施方式中，肌肉內(nèi)或在缺血損傷位點附近給予組合物。在還有另一個實 施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑敲減非肌肉肌球蛋白II基因和/或蛋白質(zhì)表達。在 還有另一個實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是靶向敲減非肌肉肌球蛋白II基因和/ 或蛋白質(zhì)表達的SiRNA。在另一個實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是靶向敲減非肌 肉肌球蛋白II基因和/或蛋白質(zhì)表達的編碼siRNA、miRNA或反義RNA的DNA載體。在其 他實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是血管緊張素II受體拮抗劑或血管緊張素受體 阻滯劑。在另一個實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制 劑。在另一個實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是2, 3-丁二酮-2--肟（BDM)。在還 有一個實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是布雷他汀或其類似物、衍生物或變體。在 還有一個實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是吡咯烷酮衍生物。在還有一個實施方式 中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是吡咯烷酮家族的分子。
[0020] 本發(fā)明的還有一個方面涉及一種試劑盒，其包含：一群多能細胞；非肌肉肌球蛋 白II拮抗劑；藥學(xué)上可接受的運載體；和可任選的，將這些物質(zhì)給予適合用干細胞療法治 療的患者的說明書。在一個實施方式中，該疾病是心血管疾病。在另一個實施方式中，該疾 病是外周動脈疾病。
[0021] 在一個實施方式中，細胞是MSC。在另一個實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑 是布雷他汀。在另一個實施方式中，心血管疾病是外周動脈疾病。在另一個實施方式中，細 胞是MSC，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是布雷他汀，且心血管疾病是外周動脈疾病。在另一個 實施方式中，試劑盒還包含心血管藥。在另一個實施方式中，試劑盒還含有支架。在另一個 實施方式中，試劑盒還包含藥物洗脫性支架。在一個實施方式中，組成試劑盒的部件置于分 隔的容器中。在另一個實施方式中，一群多能細胞；非肌肉肌球蛋白II拮抗劑；和藥學(xué)上 可接受的運載體在同一容器中，例如注射器或自動給藥裝置中。試劑盒可用于外周動脈疾 病。試劑盒可含有MSC細胞。非肌肉肌球蛋白II拮抗劑理想為布雷他汀，疾病為外周動脈 疾病。試劑盒還可包含心血管藥，和/或支架，和/或藥物洗脫性支架。各部件可在分隔的 容器中、同一容器中或在注射器中。
[0022] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種降低用包含MSC的組合物治療的外周動脈病患者 中截肢率的方法，包括在治療前使MSC接觸非肌肉肌球蛋白II拮抗劑。在一個實施方式 中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是布雷他汀。在另一個實施方式中，截肢率降低了至少約 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，或 90%或以上。
[0023] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于治療適合用干細胞療法治療的疾病的干細胞 組合物，該組合物包含一群多能細胞；和非肌肉肌球蛋白II拮抗劑。在本發(fā)明該方面的一 個實施方式中，細胞是MSC。在另一個實施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗劑是布雷他汀。
[0024] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種制備用于治療適合用干細胞療法治療的疾病的干 細胞組合物的方法，所述干細胞組合物包含一群多能細胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗劑，其 中將一群多能細胞和NM II拮抗劑一起孵育一段時間，然后給予患者。
[0025] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種使適用干細胞療法治療的疾病加速治愈的方法，包 括使用含有一群多能細胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗劑的組合物治療患者，其中該組合物 與不含非肌肉肌球蛋白II拮抗劑的組合物相比導(dǎo)致疾病更快治愈。
[0026] 在這些方面的一些實施方式中，細胞是MSC。在其他實施方式中，匪II拮抗劑是 布雷他汀。在還有其他實施方式中，疾病是心血管疾病。
【附圖說明】
[0027] 當(dāng)考慮附圖及相應(yīng)詳細描述時，可以更完整地理解本發(fā)明。附圖所示實施方式僅 僅是舉例說明發(fā)明，不應(yīng)考慮為將發(fā)明限制于所示實施方式。
[0028] 圖IA-B顯示了隨時間血流:對于所有有效動物計算各組中值。布雷他汀 (BB)加速和增強間充質(zhì)干細胞移植引發(fā)的血流再生。與預(yù)先用布雷他汀處理但在不存在布 雷他汀的情況下移植的干細胞（1A，第5組，實心黑方塊）相比，在布雷他汀存在下給予的 干細胞（1A，第4組，菱形）顯示更快且增強的動物中血流再生。含有布雷他汀的培養(yǎng)基對 照（1A，第2組，圓形）顯示少量的恢復(fù)效果，與MSC-樣，后者在稍后的時間點才獲得了恢 復(fù)（1A，第3組，三角形）。MSC的肌肉內(nèi)給藥顯示與靜脈內(nèi)施用相比持續(xù)較好的效果。數(shù) 據(jù)顯示單獨的布雷他?。˙B)對血流再生沒有效果，但在與干細胞同時施用時，布雷他汀增 強和/或支持MSC的再生潛能。
[0029] 圖2A-B顯示了隨時間的肢體功能:對于所有有效動物計算各組中值。數(shù)據(jù) 顯示與MSC共存的布雷他?。˙B)支持肢體功能的迅速改善。盡管在其他治療組中有血液 灌注改善，治療28天后觀察到肢體功能惡化和肢體壞死有所增加。第3組顯示了動物間較 廣泛的分布和較高的截肢發(fā)生率。數(shù)據(jù)顯示靜脈內(nèi)治療（2B)某種程度上效果較差，與局部 肌肉內(nèi)治療方案相比導(dǎo)致更多的并發(fā)癥（圖2A)。在布雷他汀存在下接受移植的MSC的小 鼠（2A，第4組，空心方塊）在移植后顯示隨時間穩(wěn)定和迅速的肢體功能改善。在用較低量 的布雷他汀預(yù)處理的MSC治療的小鼠中檢測到了相同趨勢（2A，第5組，三角形）。相反，單 獨施用MSC直到第20天才顯示輕微改善，而且肢體功能在后來的時間點變差。培養(yǎng)基對照 僅顯示少量效果。注意，負斜率表示肢體功能的改善。再一次，MSC的肌肉內(nèi)給藥（2A)持續(xù) 顯示優(yōu)于靜脈內(nèi)施用（2B)的效果。在布雷他汀存在下施用MSC