>[0118] 在某些實(shí)施方案中，本文中提供的抗體具有彡1 μΜ、彡ΙΟΟηΜ、彡10nM、彡InM、 彡0.1 nM、彡0.0 lnM、或彡0.0 OlnM(例如10SM或更少，例如10SM至10 13M，例如109M至 10 13M)的解離常數(shù)（Kd)。在一個實(shí)施方案中，Kd是通過放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測定法（RIA) 來測量的。在一個實(shí)施方案中，用Fab型式的感興趣抗體及其抗原實(shí)施RIA。例如，通過在存 在未標(biāo)記抗原的滴定系列的情況中用最小濃度的（1251)標(biāo)記抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗 體包被板捕捉結(jié)合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結(jié)合親和力（見例如Chen等人，J. Mol. Biol. 293 :865-881 (1999))。為了建立測定法的條件，將MICROTTTER? 多孔板（Thermo Scientific)用 50mM 碳酸鈉 （pH 9.6)中的 5μg/ml 捕捉用抗 Fab 抗體（Cappel Labs)包 被過夜，隨后用PBS中的2% (w/v)牛血清清蛋白于室溫（約23°C )封閉2-5小時。在非 吸附板（Nunc#269620)中，將ΙΟΟρΜ或26pM[125I]_抗原與連續(xù)稀釋的感興趣Fab (例如與 Presta 等人，Cancer Res. 57 :4593-4599(1997)中抗 VEGF 抗體，F(xiàn)ab-12 的評估一致）混 合。然后將感興趣的Fab溫育過夜；然而，溫育可持續(xù)更長時間（例如約65小時）以確保 達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板，于室溫溫育（例如1小時）。然后除去溶液，并 用PBS中的0. 1%聚山梨酯20 (TWEEN-20K)洗板8次。平板干燥后，加入150 μ 1/孔閃 爍液（MICR0SCINT-20?;Packard)，然后在T0PC0UNT?伽馬計數(shù)器（Packard)上對平板計數(shù) 10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20%的濃度用于競爭性結(jié)合測定法。
[0119] 依照另一個實(shí)施方案，Kd是使用BIACORE'K'表面等離振子共振測定法測量的。 例如，使用 mACOREK-2000 或mACO:REK-3000 (BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)于 25°C使用固定化抗原CM5芯片在約10個響應(yīng)單位（RU)實(shí)施測定法。在一個實(shí)施方案中，依 照供應(yīng)商的用法說明書用鹽酸N-乙基-Ν' -(3-二甲氨基丙基）-碳二亞胺（EDC)和N-羥 基琥珀酰亞胺（NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片（CM5, BIAC0RE，Inc.)。將抗原 用10mM乙酸鈉 pH 4. 8稀釋至5 μ g/ml (約0. 2 μ M)，然后以5 μ 1/分鐘的流速注射以獲得約 10個響應(yīng)單位（RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1Μ乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了 進(jìn)行動力學(xué)測量，于25°C以約25 μ 1/分鐘的流速注入在含0. 05 %聚山梨酯20 (TWEEN-20?) 表面活性劑的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(0. 78ηΜ至500ηΜ)。使用簡單一對一朗格繆 爾（Langmuir)結(jié)合模型（B[ACOR.E!< Evaluation Software version 3.2)通過同時擬 合結(jié)合和解離傳感圖計算結(jié)合速率（0和解離速率（υ。平衡解離常數(shù)（Kd)以比率k#/ k?計算。見例如Chen等人，J. Mol. Biol. 293 :865-881 (1999)。如果根據(jù)上文表面等離振子 共振測定法，結(jié)合速率超過106M 4 \那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測定，即根據(jù)分 光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計（Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINC0?分 光光度計（ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的情況中， 測量PBS pH 7. 2中20nM抗抗原抗體（Fab形式）于25°C的熒光發(fā)射強(qiáng)度（激發(fā)=295nm ; 發(fā)射=340nm，16nm帶通）的升高或降低。
[0120] 2.抗體片段
[0121] 在某些實(shí)施方案中，本文中提供的抗體是抗體片段?？贵w片段包括但不限于Fab、 Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。關(guān)于某些抗體片 段的綜述，見Hudson等人，Nat. Med. 9 :129-134(2003)。關(guān)于scFv片段的綜述，見例如 Pluckthiln,于 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編，（Springer-Verlag, New York),第 269-315 頁（1994);還可見 TO 93/16185;及 美國專利No. 5, 571，894和5, 587, 458。關(guān)于包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基，并且具有延長的 體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab'）2片段的討論，見美國專利No. 5, 869, 046。
[0122] 雙抗體是具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，其可以是二價的或雙特異性的。見 例如 EP 404,097 ;W0 1993/01161 ;Hudson 等人，Nat.Med.9 :129-134(2003);及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 (1993)。三抗體和四抗體也記載于 Hudson 等人，Nat. Med. 9 :129-134 (2003)。
[0123] 單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或整個或部分輕鏈可變域的抗體 片段。在某些實(shí)施方案中，單域抗體是人單域抗體（Domantis, Inc.，Waltham，MA ;見例如美 國專利 No. 6, 248, 516)。
[0124] 可以通過多種技術(shù)，包括但不限于對完整抗體的蛋白水解消化及重組宿主細(xì)胞 (例如大腸桿菌或噬菌體）的生成來生成抗體片段，如本文中所描述的。
[0125] 3.嵌合的和人源化的抗體
[0126] 在某些實(shí)施方案中，本文中提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體記載 于例如美國專利 No. 4, 816, 567 ;及 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 (1984))。在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區(qū)（例如，自小鼠、大鼠、倉鼠、 家兔、或非人靈長類，諸如猴衍生的可變區(qū)）和人恒定區(qū)。在又一個例子中，嵌合抗體是"類 轉(zhuǎn)換的"抗體，其中類或亞類已經(jīng)自親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片 段。
[0127] 在某些實(shí)施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以降低對人 的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多 個可變域，其中HVR，例如CDR(或其部分）自非人抗體衍生，而FR(或其部分）自人抗體序 列衍生。任選地，人源化抗體還會至少包含人恒定區(qū)的一部分。在一些實(shí)施方案中，將人源 化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體（例如衍生HVR殘基的抗體）的相應(yīng)殘基替代，例 如以恢復(fù)或改善抗體特異性或親和力。
[0128] 人源化抗體及其生成方法綜述于例如Almagro Biosci. 13 :1619-1633 (2008)，并且進(jìn)一步記載于例如 Riechmann 等人，Nature 332 : 323-329(1988) ;Queen 等人，Proc.Nat' 1 Acad. Sci. USA 86:10029-10033(1989);美 國專利 No. 5, 821，337, 7, 527, 791，6, 982, 321 和 7, 087, 409 ;Kashmiri 等人，Methods 36 :25-34(2005)(描述了 特異性決定區(qū)（SDR)嫁接）；Padlan, Mol. Immunol. 28 : 489-498(1991)(描述了"重修表面"）；Dall'Acqua等人，Methods 36 :43-60(2005)(描述了 "FR 改組"）；及 Osbourn 等人，Methods 36 :61-68(2005)和 Klimka 等人，Br. J. Cancer, 83 : 252-260 (2000)(描述了 FR改組的"引導(dǎo)選擇"方法）。
[0129] 可以用于人源化的人框架區(qū)包括但不限于：使用"最佳擬合（best-fit)"方法 選擇的框架區(qū)（見例如Sims等人，J. Immunol. 151 :2296(1993));自輕或重鏈可變區(qū)的 特定亞組的人抗體的共有序列衍生的框架區(qū)（見例如Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285 (1992);及 Presta 等人，J. Immunol. ,151 :2623 (1993));人成熟的（體 細(xì)胞突變的）框架區(qū)或人種系框架區(qū)（見例如Almagro和Fransson, Front. Biosci. 13 : 1619-1633 (2008));和通過篩選FR文庫衍生的框架區(qū)（見例如Baca等人，J. Biol. Chem. 272 :10678-10684(1997)及 Rosok 等人，J. Biol. Chem. 271 :22611-22618(1996))。
[0130] 4.人抗體
[0131] 在某些實(shí)施方案中，本文中提供的抗體是人抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的多 種技術(shù)來生成人抗體。一般地，人抗體記載于van Di jk和van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 :368-74 (2001)及 Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20 :450-459 (2008) 〇
[0132] 可以通過對轉(zhuǎn)基因動物施用免疫原來制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)修飾為 響應(yīng)抗原性攻擊而生成完整人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體。此類動物通常含有所 有或部分人免疫球蛋白基因座，其替換內(nèi)源免疫球蛋白基因座，或者其在染色體外存在 或隨機(jī)整合入動物的染色體中。在此類轉(zhuǎn)基因小鼠中，一般已經(jīng)將內(nèi)源免疫球蛋白基 因座滅活。關(guān)于自轉(zhuǎn)基因動物獲得人抗體的方法的綜述，見Lonberg, Nat. Biotech. 23 : 1117-1125(2005)。還可見例如美國專利 No. 6, 075, 181 和 6, 150, 584,其描述了 XEN0M0USE? 技術(shù)；美國專利No. 5, 770, 429,其描述了 I-IuMab?技術(shù)；美國專利No. 7, 041，870,其 描述了 K-M MOUSE?技術(shù)，和美國專利申請公開文本No. US 2007/0061900,其描述了 VelociMoiise?技術(shù)）?？梢岳缤ㄟ^與不同人恒定區(qū)組合進(jìn)一步修飾來自由此類動物生 成的完整抗體的人可變區(qū)。
[0133] 也可以通過基于雜交瘤的方法生成人抗體。已經(jīng)描述了用于生成人單克 隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤細(xì)胞系（見例如Kozbor J. Immunol.，133: 3001(1984) ；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 51-63 頁（Marcel Dekker, Inc.，New York, 1987);及 Boerner 等人， J. Immunol.，147 :86(1991))。經(jīng)由人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體也記載于Li等人， Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 103 :3557-3562 (2006)。其它方法包括那些例如記載于美國 專利No. 7, 189, 826 (其描述了自雜交瘤細(xì)胞系生成單克隆人IgM抗體）和Ni，Xiandai Mianyixue, 26 (4) :265-268 (2006)(其描述了人-人雜交瘤）的。人雜交瘤技術(shù)（Trioma 技術(shù)）也記載于 Vollmers 和 Brandlein, Hist. SHistopath.，20 (3) :927-937 (2005)及 Vollmers 和 Brandlein，Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol.，27(3) : 185-91 (2005)〇
[0134] 也可以通過分離自人衍生的噬菌體展示文庫選擇的Fv克隆可變域序列生成人抗 體。然后，可以將此類可變域序列與期望的人恒定域組合。下文描述了自抗體文庫選擇人 抗體的技術(shù)。
[0135] 5.文庫衍生的抗體
[0136] 可以通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體來分離抗體。例 如，用于生成噬菌體展示文庫并對此類文庫篩選擁有期望結(jié)合特征的抗體的多種方法 是本領(lǐng)域中已知的。此類方法綜述于例如Hoogenboom等人，Methods Mol. Biol. 178 : 1-37 (0' Brien 等人編，Human Press, Totowa, NJ, 2001)，并且進(jìn)一步記載于例如 McCafferty 等人，Nature 348 :552-554 ;Clackson 等人，Nature 352 :624-628(1991); Marks 等人，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1992) ;Marks 和 Bradbury, Methods Mol. Biol. 248 : 161-175 (Lo 編，Human Press, Totowa, NJ, 2003) ;Sidhu 等人，J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310(2004) ;Lee 等人，J. Mol. Biol. 340 (5) :1073-1093(2004) ;Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34) :12467-12472(2004);及 Lee 等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)〇
[0137] 在某些噬菌體展示方法中，將VH和VL基因的全集分別通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 克隆，并在噬菌體文庫中隨機(jī)重組，然后可以對所述噬菌體文庫篩選抗原結(jié)合噬菌體，如記 載于 Winter 等人，Ann. Rev. Immunol·, 12 :433-455(1994)的。菌體通常以單鏈 Fv(scFv) 片段或以Fab片段展示抗體片段。來自經(jīng)免疫的來源的文庫提供針對免疫原的高親和力抗 體，而不需要構(gòu)建雜交瘤?；蛘?，可以（例如自人）克隆天然全集以在沒有任何免疫的情況 中提供針對一大批非自身和還有自身抗原的抗體的單一來源，如由Griffiths等人，EMBO J，12 :725-734(1993)描述的。最后，也可以通過自干細(xì)胞克隆未重排的V基因區(qū)段，并使 用含有隨機(jī)序列的PCR引物編碼高度可變的CDR3區(qū)并在體外實(shí)現(xiàn)重排來合成生成未免疫 文庫，如由 Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol. ,227 :381-388(1992)所描述的。描述人抗 體噬菌體文庫的專利公開文本包括例如：美國專利No. 5, 750, 373、和美國專利公開文本No .2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/023776 4, 2007/0292936 和 2009/0002360。
[0138] 認(rèn)為自人抗體文庫分離的抗體或抗體片段是本文中的人抗體或人抗體片段。
[0139] 6.多特異性抗體
[0140] 在某些實(shí)施方案中，本文中提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特 異性抗體是對至少兩個不同位點(diǎn)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合 特異性之一針對感興趣多肽（諸如FGFR (例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF (例 如FGF1-23)、和/或EGFR)，而另一種針對任何其它抗原。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗 體可以結(jié)合感興趣多肽（諸如FGFR/FGF和/或EGFR)的兩個不同表位。也可以使用雙特 異性抗體來將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)感興趣多肽（諸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和 /或FGFR4)、FGF (例如FGF1-23)、和/或EGFR)的細(xì)胞。雙特異性抗體可以以全長抗體或 抗體片段制備。
[0141] 用于生成多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于具有不同特異性的兩對免疫球蛋 白重鏈-輕鏈對的重組共表達(dá)（見Milstein和Cuello, Nature 305 :537(1983))、TO 93/08829、和 Traunecker 等人，EMBO J. 10 :3655(1991))、和"隆起-入-空穴"工程化 (見例如美國專利No. 5, 731，168)。也可以通過用于生成抗體Fc-異二聚體分子的工程 化靜電操縱效應(yīng)（W0 2009/089004A1);交聯(lián)兩個或更多個抗體或片段（見例如美國專利 Ν〇·4,676,980,及Brennan等人，Science，229:81(1985));使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異 性抗體（見例如Kostelny等人，J. Immunol.，148(5) :1547-1553(1992));使用用于生成雙 特異性抗體片段的"雙抗體"技術(shù)（見例如Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90 : 6444-6448(1993));及使用單鏈 Fv(sFv)二聚體（見例如 Gruber 等人，J. Immunol.，152 : 5368(1994));及如例如Tutt等人，J. Immunol. 147 :60(1991)中所描述的，制備三特異性抗 體來生成多特異性抗體。
[0142] 本文中還包括具有三個或更多個功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程化改造抗體，包括 "章魚抗體"（見例如US 2006/0025576A1)。
[0143] 本文中的抗體或片段還包括包含結(jié)合感興趣多肽（諸如FGFR(例如FGFRUFGFR2、 FGFR3、和/或FGFR4)、FGF (例如FGF1-23)、和/或EGFR)及另一種不同抗原的抗原結(jié)合位 點(diǎn)的"雙重作用FAb"或"DAF"（見例如US 2008/0069820)。
[0144] 7.抗體變體
[0145] a)糖基化變體
[0146] 在某些實(shí)施方案中，改變本文中提供的抗體以提高或降低抗體糖基化的程度?？?以通過改變氨基酸序列，使得創(chuàng)建或消除一個或多個糖基化位點(diǎn)來方便地實(shí)現(xiàn)對抗體的糖 基化位點(diǎn)的添加或刪除。
[0147] 在抗體包含F(xiàn)c區(qū)的情況中，可以改變其附著的碳水化合物。由哺乳動物細(xì)胞生 成的天然抗體通常包含分支的、雙觸角寡糖，其一般通過N連接附著于Fc區(qū)的CH2域的 Asn297。見例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各種碳水化合物， 例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附著于雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)"主 干"中的GlcNAc的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中，可以對本發(fā)明的抗體中的寡糖進(jìn)行修飾以 創(chuàng)建具有某些改善的特性的抗體變體。
[0148] 在一個實(shí)施方案中，提供了抗體變體，其具有缺乏附著（直接或間接）于Fc區(qū)的 巖藻糖的碳水化合物結(jié)構(gòu)。例如，此類抗體中的巖藻糖量可以是1%至80%、1%至65%、 5%至65%或20%至40%。通過相對于附著于Asn297的所有糖結(jié)構(gòu)（例如，復(fù)合的、雜合 的和高甘露糖的結(jié)構(gòu)）的總和，計算Asn297處糖鏈內(nèi)巖藻糖的平均量來測定巖藻糖量，如 通過MALDI-T0F質(zhì)譜術(shù)測量的，例如如記載于W0 2008/077546的。Asn297指位于Fc區(qū)中 的約第297位（Fc區(qū)殘基的Eu編號方式）的天冬酰胺殘基；然而，Asn297也可以由于抗體 中的微小序列變異而位于第297位上游或下游約±3個氨基酸，即在第294位和第300位 之間。此類巖藻糖基化變體可以具有改善的ADCC功能。見例如美國專利公開文本No. US 2003/0157108 (Presta，L.);US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及"脫 巖藻糖基化的"或"巖藻糖缺乏的"抗體變體的出版物的例子包括：US 2003/0157108 ;TO 2000/61739 ；W0 2001/29246 ；US 2003/0115614 ；US 2002/0164328 ；US 2004/0093621 ；US 2004/0132140 ；US 2004/0110704 ；US 2004/0110282 ；US 2004/0109865 ；W0 2003/085119； W0 2003/084570 ；W0 2005/035586 ；W0 2005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140 ； Okazaki 等人，J.Mol.Biol. 336 :1239-1249(2004) ;Yamane_0hnuki 等人，Biotech. Bioeng. 87:614(2004)。能夠生成脫巖藻糖基化抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖 基化缺陷的 Lecl3CH0 細(xì)胞（Ripka 等人，Arch. Biochem. Biophys. 249 :533-545(1986);美 國專利申請 No US 2003/0157108 Al，Presta，L;及 W0 2004/056312 Al, Adams 等人，尤其 在實(shí)施例11)，和敲除細(xì)胞系，諸如α -1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 FUT8敲除CH0細(xì)胞（見 例如 Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioeng. 87 :614(2004) ;Kanda，Y.等人，Biotechnol. Bioeng. ,94 (4) :680-688(2006);及 W02003/085107) 〇
[0149] 進(jìn)一步提供了具有兩分型寡糖的抗體變體，例如其中附著于抗體Fc區(qū)的雙觸角 寡糖是通過GlcNAc兩分的。此類抗體變體可以具有降低的巖藻糖基化和/或改善的ADCC 功能。此類抗體變體的例子記載于例如W0 2003/011878(Jean-Mairet等人）；美國專利 吣.6,602,684(1]1^仙等人）；及1^ 2005/0123546(1]1^仙等人）。還提供了在附著于？(3區(qū) 的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此類抗體變體可以具有改善的CDC功能。 此類抗體變體記載于例如 W0 1997/30087 (Patel 等人）；W0 1998/58964 (Raju, S.);及 TO 1999/22764(Raju, S.)。
[0150] b)Fc 區(qū)變體
[0151] 在某些實(shí)施方案中，可以將一處或多處氨基酸修飾引入本文中提供的抗體的Fc 區(qū)中，由此生成Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可以包含在一個或多個氨基酸位置包含氨基酸修飾 (例如替代）的人Fc區(qū)序列（例如，人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)）。
[0152]