Adp核糖基化因子6在防治腸道病毒71型感染中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種抗腸道病毒71型感染的新靶點(diǎn)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71)屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬人腸 道A類病毒，是導(dǎo)致手足口?。℉and-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原體之一。目 前，手足口病在世界多個(gè)地區(qū)暴發(fā)并流行，尤其是亞太地區(qū)。在我國，自2008年幾大省市 暴發(fā)手足口病疫情以來，該病的感染人數(shù)和死亡率一直居高不下，每年報(bào)告發(fā)病數(shù)超過100 萬例，死亡數(shù)近1000例。手足口病主要發(fā)病人群為5歲以下嬰幼兒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，手、 足、臀部以及口腔粘膜等部位出現(xiàn)皰疹等癥狀；少數(shù)患兒可發(fā)展為重癥患者，出現(xiàn)中樞神 經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS)病變，包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎、腦脊髓炎以 及神經(jīng)源性肺水腫等，嚴(yán)重威脅著嬰幼兒的生命健康[Solomon Tl, Lewthwaite P, Perera DjCardosa MJjMcMinn PjOoi ΜΗ. Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71. Lancet Infect Dis.2010Nov;10(ll) :778-90.]。手足口病特別是重癥病 例多由腸道病毒71型（EV71)感染所致。然而，目前關(guān)于EV71引起手足口病的治療尚無特 異高效的抗病毒藥物，臨床上仍以對(duì)癥治療為主，在預(yù)防方面也無有效疫苗問世。
[0003] EV71感染具有嗜神經(jīng)性，易造成嚴(yán)重的CNS疾病及其并發(fā)癥，這也是導(dǎo)致手足口 病患者發(fā)展為重癥甚至死亡的主要原因。其中，腦干是最易被EV71感染的部位[Tee，K. K. , et al.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin, population dynamics,natural selection,and seasonal periodicity of the VPlgene.J Virol，2010. 84(7) :p. 3339-50.]，研究證實(shí)在EV71重癥患者的腦干神經(jīng)元等部位均能夠 檢測(cè)到EV71基因及抗原的存在，證明EV71能進(jìn)入CNS。EV71經(jīng)血液循環(huán)感染CNS需要穿越 血腦屏障，然而病毒如何穿過血腦屏障侵入CNS的機(jī)制還不清楚。血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB)是位于循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間一道主要的屏障，它限制著不同物質(zhì)在 兩個(gè)部位之間的自由運(yùn)輸，對(duì)維持CNS的體內(nèi)平衡以及保護(hù)CNS免受外界病原微生物的侵 襲中起著至關(guān)重要的作用[Dyrna F, Hanske S, Krueger M, Bechmann I. The blood-brain barrier. J Neuroimmune Pharmacol. 2013 ;8 (4) : 763-73.]。血腦屏障是由無窗孔的腦微 血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、細(xì)胞基膜和周細(xì)胞共同組成的一個(gè) 細(xì)胞復(fù)合體。在這個(gè)細(xì)胞復(fù)合體中，最主要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)及其緊密連接，其嚴(yán)整性的丟失被認(rèn)為是病毒 感染致腦組織損傷的一個(gè)重要原因。因此，探明EV71感染BMECs的機(jī)制并以此尋找新的 抗病毒靶點(diǎn)，對(duì)于保護(hù)血腦屏障的功能，以及防治EV71所導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染至關(guān)重 要。
[0004] 為了有效地感染細(xì)胞，病毒必須利用宿主細(xì)胞的膜分子及其囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)完成 對(duì)宿主細(xì)胞的入侵，才能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制并釋放出有感染性的子代病毒顆粒。因此， 作為病毒感染宿主細(xì)胞的首要環(huán)節(jié)，細(xì)胞入侵已成為抗病毒藥物篩選的重要靶標(biāo)。研究 表明，EV71可利用不同的宿主因子和感染途徑來入侵不同種類的靶細(xì)胞，比如EV71借助 網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑（clathrin-mediated endocytosis)感染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞 (rhabdomyosarcoma, RD)[Yamayoshi, S. , et al. , Scavenger receptor B2is a cellular receptor for enterovirus71· Nat Med,2009. 15(7) :p.798_80L];而感染 Jurkat T 淋巴細(xì)胞系則主要利用小窩依賴的內(nèi)吞途徑（caveolar-dependent endocytosis) [Lin HY, Yang YT,Yu SL,et al. Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71infection. J Virol. 2013, 87 (16):9064-76·]。目前，關(guān) 于EV71感染BMECs的途徑及機(jī)制仍不清楚。
[0005] 病毒侵入靶細(xì)胞主要借助了參與宿主細(xì)胞自身物質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵分子，這些宿主 細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子在細(xì)胞的跨膜物質(zhì)運(yùn)輸，囊泡的形成、內(nèi)吞以及分泌中發(fā)揮著重要的作 用。如金屬蛋白酶調(diào)節(jié)了細(xì)胞粘附，細(xì)胞膜分子的降解；網(wǎng)格蛋白（clathrin)主要負(fù) 責(zé)受體介導(dǎo)的的內(nèi)吞過程；小窩蛋白家族分子caveolin-1 (CAVl)、caveolin-2 (CAV2)、 caveolin-3(CAV3)將物質(zhì)運(yùn)輸至高爾基體；Flotillin分子能夠與脂後內(nèi)蛋白分子相互作 用并內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)；ADP核糖基化因子6分子參與調(diào)解細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸和胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白裝配； GTP酶激活蛋白分子GRAFl在網(wǎng)格蛋白非依賴型的囊泡運(yùn)輸中具有重要的調(diào)節(jié)作用；白細(xì) 胞介素2受體內(nèi)吞調(diào)節(jié)了信號(hào)通路并影響了細(xì)胞增殖（Jason Mercer，Mario Schelhaas，et al. Virus Entry by Endocytosis. Annu Rev Biochem. 2010;79:803-833·)。在這些分子 中，caveolin-1和clathrin被證實(shí)分別參與了 EV71感染Jurkat T淋巴細(xì)胞和RD細(xì)胞的 過程，而其它分子在EV71感染中的作用還未有報(bào)道。
[0006] ADP 核糖基化因子 6 (ADP ribosylation factor 6，ARF6)是 Ras 超家族中的一個(gè) 小分子GTP結(jié)合蛋白，屬于ARF亞家族成員，位于細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)涵體膜上，主要參與調(diào)節(jié)質(zhì) 膜運(yùn)輸和胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白裝配而涉及到多種生理功能（Gillingham AK1, Munro S. The small G proteins of the Arf family and their regulators. Annu Rev Cell Dev Biol.2007 ； 23:579-611.)。近年來研究也發(fā)現(xiàn)ARF6分子在病毒的感染過程中發(fā)揮著重要的作用， HeikkilE 〇等人發(fā)現(xiàn)ARF6分子調(diào)節(jié)了柯薩奇病毒A9型感染宿主細(xì)胞（HeikMM 〇1，Susi P,Tevalu〇t〇 T, Hanna H, Marjoinaki V, Hyypia T1Kiljunen S. Internalization of coxsackievirus A9is mediated by {beta}2-microglobulin, dynamin, and ArfObut not by caveolin-lor clathrin. J Virol. 2010 ;84(7) :3666-81.)。人橫紋肌肉瘤 RD 細(xì)胞是 EV71的敏感細(xì)胞系，然而Khairunnisa等通過基因組文庫篩選發(fā)現(xiàn)ARF6分子并未影響 EV71 對(duì) RD 細(xì)胞的感染（Hussain KM1, Leong KL, Ng MM, Chu JJ. The essential role of clathrin-mediated endocytosis in the infectious entry of human enterovirus 71.J Biol Chem. 2011 ；286 (I):309-21.)〇
[0007] 目前還沒有任何關(guān)于ARF6分子在EV71感染HBMEC中作用的報(bào)道，對(duì)于該分子進(jìn) 行深入研究不僅能夠提升對(duì)EV71感染與致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也可以為預(yù)防與治療EV71感染 提供新的思路與靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗腸道病毒71型感染的新靶點(diǎn)。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供ADP核糖基化因子6(ARF6)分子的新用途，特別是在 抗腸道病毒71型感染中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第三目的在于提供干擾ARF6分子表達(dá)的siRNA。
[0011] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：
[0012] 本發(fā)明，以人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC)作為靶細(xì)胞，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào) 靶細(xì)胞宿主蛋白的表達(dá)，來尋找可有效抑制EV71感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC)的 宿主因子，從而保護(hù)血腦屏障的功能。本實(shí)驗(yàn)選擇了一組宿主細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子來進(jìn)行 篩選，這些分子在宿主細(xì)胞的跨膜物質(zhì)運(yùn)輸，囊泡的內(nèi)吞與分泌中發(fā)揮著重要作用，它們 往往也是在病毒感染過程中易被病毒"劫持"并利用的分子。這些分子包括：ADAM金屬 蛋白酶（ADAMlO)、ADP 核糖基化因子 6(ARF6)、caveolin-1 (CAVl)、caveolin-2(CAV2)、 caveo I in-3 (CAV3)、網(wǎng)格蛋白輕鏈A (CLTA)、網(wǎng)格蛋白輕鏈B (CLTB)、網(wǎng)格蛋白重鏈（CLTC)、 Flotillin 蛋白 I (FLOTl)、Floti 11 in 蛋白 2 (FL0T2)、GTP 酶激活蛋白（GRAFl)、白細(xì)胞介素 2受體（IL2RB)、突觸結(jié)合蛋白I(SYTl)、突觸結(jié)合蛋白2(SYT2)。通過檢索NCBI GeneBank 得到全序列和mRNA序列，利用現(xiàn)有的網(wǎng)絡(luò)資源及常用軟件對(duì)這些基因進(jìn)行生物學(xué)分析，選