色檢測EV71抗原表達(dá)
[0077] HBMEC細(xì)胞感染病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用免疫熒光法檢測病毒抗原的表達(dá)，具體 步驟如下：
[0078] 1)細(xì)胞固定：將96孔板中的培養(yǎng)液移去，加入PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入100 μ 1 預(yù)冷甲醇，于_20°C條件下固定20min，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次。
[0079] 2)透膜：固定后的細(xì)胞每孔加入100μ 1 0· 1% TritonX-100,室溫孵育15min，用 預(yù)冷PBS洗滌3次。
[0080] 3)封閉：每孔加入100 μ 1 3% BSA，于室溫下孵育lh。
[0081] 4) 一抗孵育：每孔加入EV71特異性鼠源單抗10F0 (1:2000稀釋）100 μ 1，室溫孵 育Ih，用預(yù)冷的PBS洗滌3次。
[0082] 5)二抗孵育：每孔加入AF 488熒光標(biāo)記抗鼠 IgG(l: 1000稀釋）100 μ 1，室溫避光 孵育Ih，用預(yù)冷的PBS避光洗滌2次。
[0083] 6)標(biāo)記細(xì)胞核：每孔加入細(xì)胞核熒光染料DAPI (1:5000, PBS稀釋），室溫避光孵育 15min，用預(yù)冷的PBS避光洗滌3次。
[0084] 7)熒光顯微鏡下檢測并計算綠色AF 488陽性細(xì)胞克隆數(shù)。
[0085] 4. 3蛋白免疫印跡。
[0086] (1)用蛋白裂解液分別提取對照組與ARF6干擾組HBMEC細(xì)胞的總蛋白。
[0087] (2)蛋白質(zhì)定量后分別將30ug蛋白加到12. 5%濃度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并 截取相應(yīng)條帶用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)到PVDF膜上。
[0088] (3)蛋白的非特異性位點用5%的脫脂牛奶封閉，然后用ARF6抗體封閉，4°C過夜， 用TBST緩沖液洗三遍，洗去一抗。
[0089] (4)然后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2小時，繼而用TBST緩沖液洗三遍。
[0090] (5)最后，利用顯色液顯色并拍照分析.
[0091] 4. 4RT-PCR檢測細(xì)胞中EV71病毒量
[0092] HBMEC細(xì)胞感染病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用TRIzoI提取對照組與干擾組細(xì)胞的總 RNA，并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過RT-PCR檢測EV71病毒量。具體步驟同2. 2所示。
[0093] 實驗結(jié)果：
[0094] 1設(shè)計、合成并篩選有效的SiRNA
[0095] 針對各個目的基因序列，我們設(shè)計了多個RNA干擾靶點序列，并利用設(shè)計軟件進(jìn) 行預(yù)評估測定，選擇3個最佳的動力學(xué)參數(shù)靶點進(jìn)入后續(xù)實驗流程，每一基因共合成3條干 擾序列，如表1所示。
[0096] 采用體外轉(zhuǎn)染的方法，將各個基因的干擾RNA轉(zhuǎn)染到HBMEC細(xì)胞中去，48h后通過 RT-PCR法檢測各干擾RNA的干擾效率，最終篩選到干擾效果最佳的siRNA序列（表2中加 粗序列）進(jìn)行后續(xù)實驗，其干擾效率如表2所示。
[0097] 表2 RT-PCR法檢測siRNA干擾序列對相關(guān)宿主基因的下調(diào)效率
[0098]

[0100] 注：CTRL :不轉(zhuǎn)染任何SiRNA的HBMEC細(xì)胞組（空細(xì)胞組）
[0101] NT :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細(xì)胞組（陰性對照組）
[0102] siRNA :轉(zhuǎn)染針對各目的基因的siRNA的HBMEC細(xì)胞組（實驗組）。
[0103] 2siRNA干擾后的干擾效率以及細(xì)胞毒性檢測
[0104] 挑選出的針對各宿主分子的有效siRNA轉(zhuǎn)染HBMEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h通過RT-PCR 法檢測各干擾RNA的干擾效率，同時采用CCK8檢測轉(zhuǎn)染后對HBMEC細(xì)胞毒性的影響。
[0105] 結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染有效siRNA組與CTRL組相比，轉(zhuǎn)染各siRNA后能夠明顯抑制 相應(yīng)基因的表達(dá)水平（Ρ<〇·〇1)。轉(zhuǎn)染ARF6siRNA(SEQ ID N0:4)的抑制效率可達(dá)到61%。
[0106] 細(xì)胞毒性實驗表明，各siRNA轉(zhuǎn)染后并沒有產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性（P> 0.05)，對細(xì) 胞正常的生理功能未產(chǎn)生影響，可用于后續(xù)實驗。
[0107] 3siRNA干擾后對EV71病毒感染的影響
[0108] 轉(zhuǎn)染各宿主分子的有效siRNA來下調(diào)宿主細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)后，感染相同劑量 的EV71病毒，感染48h后，采用免疫熒光法檢測各宿主分子下調(diào)后對EV71感染的影響，發(fā) 現(xiàn)與對照組相比，轉(zhuǎn)染ARF6siRNA(SEQ ID N0:4)使ARF6基因下調(diào)后，明顯降低了 EV71對 HBMEC細(xì)胞的感染（圖2A)。通過計算病毒量發(fā)現(xiàn)，ARF6基因下調(diào)后對病毒的抑制率達(dá)到 87. 65%，而其余分子的下調(diào)并沒有明顯抑制EV71對HBMEC細(xì)胞的感染（P > 0. 05)(圖2B)。
[0109] 為明確ARF6對EV71感染的抑制作用，在轉(zhuǎn)染ARF6分子siRNA后，通過免疫印跡 法檢測ARF6蛋白分子的表達(dá)，并在感染EV71后觀察細(xì)胞病變情況，以及通過RT-PCR檢測 EV71病毒量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ARF6分子siRNA(SEQ ID N0:4)后，能夠明顯抑制ARF6蛋白 分子的表達(dá)（圖3A)。與對照組相比，ARF6蛋白表達(dá)下調(diào)后，能夠抑制細(xì)胞病變且HBMEC細(xì) 胞中的病毒量也顯著下降（圖3B，C)，與免疫熒光法檢測結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明，與對 照細(xì)胞相比，下調(diào)ARF6基因后EV71對HBMEC細(xì)胞的感染能力明顯下降，病毒量減少。
[0110] 進(jìn)一步，分別轉(zhuǎn)染三條ARF6分子的siRNA觀察對病毒感染性的影響。結(jié)果表明不 同的siRNA對ARF6分子的下調(diào)效率不同（圖4A)，其中siRNA(SEQ ID NO:4)的干擾效率最 高，與前面的結(jié)果相一致。檢測干擾后對EV71感染性的影響發(fā)現(xiàn)，三條ARF6分子的siRNA 對病毒感染的抑制率均可達(dá)到65%以上，而且隨著對ARF6分子的下調(diào)效率的增高，對EV71 感染的抑制率也在升高（圖4B)，提示ARF6分子在EV71感染HBMEC中發(fā)揮著重要作用。因 此，ARF6可作為抑制EV71對HBMEC細(xì)胞感染的新的宿主靶點。
[0111] 通過以上實驗結(jié)果證明：本發(fā)明篩選到能夠抑制EV71感染HBMEC細(xì)胞的一個新的 宿主細(xì)胞分子ARF6。ARF6基因下調(diào)以后，不影響細(xì)胞正常的生理功能，但明顯抑制了 EV71 對HBMEC細(xì)胞的感染。因此本發(fā)明為臨床預(yù)防和治療因 EV71感染所導(dǎo)致的血腦屏障的失 能提供了新的靶點和治療方案。
[0112] 以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. ADP核糖基化因子6在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用。 2. ADP核糖基化因子6在制備預(yù)防或治療手足口病藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ADP核糖基化因子6在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染 藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是指能夠抑制或下調(diào)ADP核糖基化因子6的表達(dá)量 的試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的ADP核糖基化因子6在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染 藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的能夠抑制或下調(diào)ADP核糖基化因子6的表達(dá)量的試劑是 ADP核糖基化因子6的siRNA、shRNA或包含siRNA、shRNA的重組載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ADP核糖基化因子6在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染 藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是ADP核糖基化因子6的干擾RNA，所述的干擾RNA 的序列選自以下任一： GCUCACAUGGUUAACCUCUAA(SEQIDN0:4)、 ⑶CAAGUUCAACGUAUGGGAU(SEQIDN0:5)、 GCAUUAUCAAUGACCGGGAGA(SEQIDN0:6)〇6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的ADP核糖基化因子6在制備預(yù)防或治療手足口病藥物中的應(yīng) 用，其特征在于，所述的藥物是指能夠抑制或下調(diào)ADP核糖基化因子6的表達(dá)量的試劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的ADP核糖基化因子6在制備預(yù)防或治療手足口病藥物中的應(yīng) 用，其特征在于，所述的能夠抑制或下調(diào)ADP核糖基化因子6的表達(dá)量的試劑是ADP核糖基 化因子6的siRNA、shRNA或包含siRNA、shRNA的重組載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的ADP核糖基化因子6在制備預(yù)防或治療手足口病藥物中的應(yīng) 用，其特征在于，所述的藥物是ADP核糖基化因子6的干擾RNA，所述的干擾RNA的序列選自 以下任一： GCUCACAUGGUUAACCUCUAA(SEQIDN0:4)、 ⑶CAAGUUCAACGUAUGGGAU(SEQIDN0:5)、 GCAUUAUCAAUGACCGGGAGA(SEQIDNO:6)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種抗腸道病毒71型感染的新靶點及應(yīng)用。本發(fā)明以人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)作為靶細(xì)胞，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)靶細(xì)胞宿主蛋白的表達(dá)，來尋找可有效抑制EV71感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的宿主因子，從而保護(hù)血腦屏障的功能，預(yù)防病毒穿過血腦屏障感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)ADP核糖基化因子6(ADP？ribosylation？factor？6，ARF6)在EV71感染HBMEC中發(fā)揮著重要的作用，下調(diào)ARF6的表達(dá)，能明顯抑制EV71的感染。本發(fā)明提供了ARF6在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用。
【IPC分類】A61P31/14, A61K48/00, A61K31/7088
【公開號】CN105267984
【申請?zhí)枴緾N201510030998
【發(fā)明人】朱勇喆, 徐慶強(qiáng), 戚中田, 趙平, 陳生林
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年1月21日