擇編碼區(qū)作為siRNA設計的靶序列，然后設計SiRNA，通過下調這些分子，來觀察對EV71感 染的影響。
[0013] 我們發(fā)現(xiàn) ADP 核糖基化因子 6 (ADP ribosylation factor 6，ARF6)在 EV71 感染 HBMEC中發(fā)揮著重要的作用，下調ARF6的表達，能明顯抑制EV71的感染。
[0014] 本發(fā)明的第一方面，提供了 ADP核糖基化因子6 (ARF6)作為一種抗腸道病毒71型 感染的新靶點。
[0015] 本發(fā)明的第二方面，提供了 ADP核糖基化因子6(ARF6)在制備預防或治療腸道病 毒71型感染藥物中的應用。
[0016] 進一步地，本發(fā)明還提供ADP核糖基化因子6 (ARF6)在制備預防或治療手足口病 藥物中的應用。
[0017] 本發(fā)明所述的ADP核糖基化因子6 (ARF6)在制備預防或治療腸道病毒71型感染 藥物中的應用，該藥物具體是指能夠抑制或下調ARF6的表達量的試劑。
[0018] 所述的抑制下調ARF6的表達量的試劑可以是siRNA、shRNA、包含siRNA、shRNA的 重組載體（如質粒）等。
[0019] 本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了 ADP核糖基化因子6(ARF6)的干擾RNA在制備 預防或治療腸道病毒71型感染藥物中的應用，或ADP核糖基化因子6在制備預防或治療手 足口病藥物中的應用，所述的藥物為干擾RNA (siRNA)，其序列如下：
[0020] GCUCACAUGGUUAACCUCUAA(SEQ ID N0:4)
[0021] ⑶CAAGUUCAACGUAUGGGAU(SEQ ID N0:5)
[0022] GCAUUAUCAAUGACCGGGAGA(SEQ ID NO :6)
[0023] 其中，以如SEQ ID NO: 4所示的siRNA下調ARF6的表達量效果最佳，且降低EV71 對HBMEC細胞的感染最為明顯。
[0024] 本發(fā)明篩選到能夠抑制EV71感染HBMEC細胞的一個新的宿主細胞分子ARF6JRF6 基因下調以后，不影響細胞正常的生理功能，但明顯抑制了 EV71對HBMEC細胞的感染。
[0025] 因此本發(fā)明為臨床預防和治療因 EV71感染所導致的血腦屏障的失能提供了新的 靶點和治療方案。
【附圖說明】
[0026] 圖1為轉染有效siRNA后的干擾效率及細胞毒性檢測，圖中主坐標軸表示干擾效 率，次坐標軸表示對細胞毒性的影響；
[0027] CTRL :不轉染任何siRNA的HBMEC細胞組（空細胞組）；
[0028] NT :轉染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細胞組（陰性對照組）；
[0029] siRNA :轉染針對各目的基因的siRNA的HBMEC細胞組（實驗組）。
[0030] 圖2為免疫熒光法檢測各宿主分子下調后對EV71感染的影響，其中A為下調各分 子后對病毒感染性的熒光檢測圖，B為下調各分子后對病毒感染的抑制率圖；
[0031] CTRL :不轉染任何siRNA的HBMEC細胞組（空細胞組）；
[0032] NT :轉染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細胞組（陰性對照組）；
[0033] siRNA :轉染針對各目的基因的siRNA的HBMEC細胞組（實驗組）。
[0034] 圖3為ARF6下調后對EV71感染的影響，其中A為Western Blot檢測ARF6蛋白 的表達圖，B為觀察EV71的細胞病變效應圖，C為檢測EV71病毒量圖；
[0035] CTRL :不轉染任何siRNA的HBMEC細胞組（空細胞組）；
[0036] NT-CTRL :轉染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細胞組（陰性對照組）；
[0037] ARF6 :轉染針對 ARF6 基因的 siRNA(SEQ ID N0:4)的 HBMEC 細胞組。
[0038] 圖4為轉染ARF6分子的不同干擾序列后的干擾效率及對EV71感染性的影響圖， A為ARF6基因的mRNA水平檢測圖，B為EV71病毒量檢測圖；
[0039] CTRL :不轉染任何siRNA的HBMEC細胞組（空細胞組）；
[0040] NT-CTRL :轉染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細胞組（陰性對照組）；
[0041] ARF6-4 :轉染針對 ARF6 基因的 siRNA(SEQ ID N0:4)的 HBMEC 細胞組；
[0042] ARF6-5 :轉染針對 ARF6 基因的 siRNA (SEQ ID NO: 5)的 HBMEC 細胞組；
[0043] ARF6-6 :轉染針對 ARF6 基因的 siRNA(SEQ ID N0:6)的 HBMEC 細胞組。
【具體實施方式】
[0044] 現(xiàn)結合實施例和附圖，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
[0045] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻方法制備。下列實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩嶒炇抑改稀罚∟ew York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0046] 實施例1 :
[0047] 1設計、合成各宿主細胞分子的特異性siRNA序列。
[0048] I. 1針對各個目的基因，檢索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用現(xiàn)有 的網絡資源及常用軟件對各目的基因進行生物學分析，選擇編碼區(qū)作為siRNA設計的靶序 列。參照siRNA設計原則，并通過GeneBank數(shù)據(jù)庫的blast功能與人類基因組序列進行對 I：匕，確保無同源性；排除aitisense鏈的5'端連續(xù)8個堿基與其它基因配對的潛在siRNA ; 排除任何一段連續(xù)14個堿基與其它基因配對的潛在siRNA。并利用設計軟件進行預評估測 定，選擇3個最佳的動力學參數(shù)靶點進入后續(xù)實驗流程，每一基因共合成3條干擾序列，見 表1。
[0049] I. 2單鏈siRNA的合成與純化由Invitrogen公司完成。
[0050] 表1 · s i RNA靶點的設計

[0053] 2siRNA序列篩選與干擾效果鑒定
[0054] 2. IRNA 轉染
[0055] 轉染步驟參照Lipofectamine 2000說明書
[0056] 1)提前12-16小時將HBMEC細胞（購自Sciencell，保藏號：1000)鋪在24孔細 胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使得轉染時細胞密度為80% -90%。
[0057] 2)取 2 μ L Lipofectamine 2000 加入 50 μ L opti-MEM 中并輕柔混勻，室溫孵育 5 分鐘；另取5 μ L濃度為5 μ M的干擾RNA和50 μ L opti-MEM混合。孵育結束后，將稀釋的 Lipofectamine 2000轉染試劑加入稀釋的RNA中，并輕柔吹吸混勻。室溫孵育20min后，加 入HBMEC細胞中，補加400 μ L opti-MEM，使得RNA終濃度為50nM。
[0058] 3)轉染后6-8小時更換含有雙抗的新鮮培養(yǎng)基。
[0059] 2. 2實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測各宿主分子的mRNA水平
[0060] I) TRIzoI提取對照組與干擾組細胞的總RNA，具體步驟如下：
[0061] 轉染48小時后，去培養(yǎng)上清，在細胞中加入1ml TRIzol，充分混合室溫裂解細胞 3-5分鐘。加入1/5體積的氯仿，手動劇烈混合15秒。于4°C、12, 000轉離心15分鐘。取 上層水相并轉移到新的EP管中，加入等體積異丙醇，充分混合，室溫沉淀10分鐘。于4°C、 12, 000轉離心10分鐘。棄上清，加入1ml預冷的75%乙醇。于4°C、12, 000離心5分鐘。 充分棄上清，室溫晾干RNA沉淀，加入DEPC處理水溶解沉淀，得到總RNA。
[0062] 2)利用takara反轉錄試劑盒獲取對照組與干擾組細胞的cDNA，具體步驟如下：
[0063] 在PCR管中加入如下反應體系，
[0065] 輕柔混合混勻，置于37°C反應15分鐘，然后置于85°C加熱5秒鐘滅活逆轉錄酶。
[0066] 3)熒光定量RT-PCR檢測
[0067] 利用takara的SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行反應，反應體系如下，
[0069] 利用Rotor Gene 3000A儀器進行兩步法擴增，95°C預變性2min，進行40個PCR循 環(huán)，95°C 5 秒，60°C 30 秒。
[0070] 3細胞毒性實驗
[0071] 采用CCK-8方法檢測轉染SiRNA后對細胞增殖的影響，具體步驟如下：
[0072] 收集對數(shù)生長期細胞，以每孔3000個的密度接種于96孔板。待細胞過夜貼壁 后，轉染各siRNA，培養(yǎng)48小時后檢測細胞增殖情況。棄去原有培養(yǎng)基，每孔加入含10 μ L CCK-8的新鮮培養(yǎng)基110 μ L，培養(yǎng)3h后用多功能酶標儀在450nm波長檢測各孔吸光度值。 實驗獨立重復3次，計算平均值。
[0073] 4EV71病毒感染HBMEC細胞
[0074] 4. IHBMEC細胞的EV71病毒感染實驗
[0075] HBMEC細胞轉染RNA后72小時，進行EV71病毒感染實驗。將培養(yǎng)上清吸出，用預 溫PBS潤洗2次，以MOI = 0. 1的病毒量接種EV71，37°C孵育2h后棄去病毒液，并用預溫 PBS潤洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0076] 4. 2免疫熒光染