含靈芝和銀杏葉的中藥組合物用于中風(fēng)后促進(jìn)康復(fù)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含靈芝和銀杏葉的中藥組合物用于中風(fēng) 后促進(jìn)康復(fù)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中風(fēng)，中醫(yī)病名，有外風(fēng)和內(nèi)風(fēng)之分，外風(fēng)因感受外邪（風(fēng)邪）所致，在《傷寒論》名 曰中風(fēng)（亦稱桂枝湯證）；內(nèi)風(fēng)屬內(nèi)傷病證，又稱類中風(fēng)，腦卒中，卒中，風(fēng)痱?，F(xiàn)代一般稱 中風(fēng)多指內(nèi)傷病證的類中風(fēng)，多因氣血逆亂、腦脈痹阻或血溢于腦所致。以突然昏仆、半身 不遂、肢體麻木、舌蹇不語，口舌歪斜，偏身麻木等為主要表現(xiàn)的腦神疾病，并具有起病急、 變化快，如風(fēng)邪善行數(shù)變的特點(diǎn)。
[0003] 發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)探索發(fā)現(xiàn)一種含靈芝和銀杏葉的中藥組合物用于制備中風(fēng)后促進(jìn) 康復(fù)的藥物的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種含靈芝和銀杏葉的中藥組合物在制備中風(fēng)后促進(jìn)康復(fù) 的藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種含有靈芝和銀杏葉的中藥組合物在制備中風(fēng)后促進(jìn)康復(fù)的藥物中的應(yīng)用，其 中，該組合物由以下重量份的組分制成：
[0007] 靈芝300-400重量份銀杏葉300-400重量份淮牛膝200-290重量份
[0008] 玄參200-290重量份石昌蒲150-190重量份天麻 100-140重量份
[0009] 上述組合物優(yōu)選由以下組分制成：
[0010] 靈芝300-350重量份銀杏葉300-350重量份淮牛膝250-290重量份
[0011] 玄參250-290重量份石昌蒲150-180重量份天麻 110-140重量份
[0012] 上述組合物最優(yōu)選由以下組分制成：
[0013] 靈芝333重量份銀杏葉333重量份淮牛膝278重量份
[0014] 玄參278重量份石菖蒲167重量份天麻125重量份
[0015] 上述中藥組合物可與藥學(xué)上允許的輔料制成藥學(xué)規(guī)定的劑型，所述的劑型優(yōu)選為 膠囊劑。
[0016] 該組合物的制備方法包括以下步驟：
[0017] a、將石菖蒲粉碎成顆粒；
[0018] b、將石菖蒲顆粒采用CO2超臨界萃取，萃取壓力為22_30Mpa，萃取釜溫度為 45-60°C，萃取時間為0. 5-1. 5小時，得揮發(fā)油和石菖蒲萃余物；
[0019] c、取揮發(fā)油用等體積的乙醇溶解，得揮發(fā)油乙醇溶液；另取揮發(fā)油重量4-8倍量 的β-環(huán)糊精，用β-環(huán)糊精3-5倍量的水研勻，倒入膠體磨中，緩慢連續(xù)滴加上述揮發(fā)油 乙醇溶液，碾磨包合20-40分鐘，傾出，0-4 °C冷藏靜置24小時以上，濾過，于40-80°C真空干 燥，即得揮發(fā)油包合物；
[0020] d、靈芝、銀杏葉、淮牛膝、玄參和天麻、以及石菖蒲萃余物加入處方總藥材6-10倍 重量濃度為70-90%的乙醇，加熱回流提取1-3次，每次1-2小時，提取液合并，靜置，濾過， 濾液減壓回收乙醇，濃縮至60°C條件下相對密度為1. 15~1. 30的清膏；
[0021] e、將清膏在60_80°C減壓干燥，得干膏；
[0022] f、將干膏和揮發(fā)油包合物混合均勻。
[0023] 上述組合物的制備方法優(yōu)選包括以下步驟：
[0024] a、將石菖蒲粉碎成顆粒；
[0025] b、將石菖蒲顆粒采用CO2超臨界萃取，萃取壓力為22_30Mpa，萃取釜溫度為 45-60°C，萃取時間為0. 5-1. 5小時，得揮發(fā)油和石菖蒲萃余物；
[0026] c、取揮發(fā)油用等體積的乙醇溶解，得揮發(fā)油乙醇溶液；另取揮發(fā)油重量4-8倍量 的β-環(huán)糊精，用β-環(huán)糊精3-5倍量的水研勻，倒入膠體磨中，緩慢連續(xù)滴加上述揮發(fā)油 乙醇溶液，碾磨包合20-40分鐘，傾出，0-4 °C冷藏靜置24小時以上，濾過，于40-80°C真空干 燥，即得揮發(fā)油包合物；
[0027] d、靈芝、銀杏葉、淮牛膝、玄參和天麻、以及石菖蒲萃余物加入處方總藥材6-10倍 重量濃度為70-90%的乙醇，加熱回流提取1-3次，每次1-2小時，提取液合并，靜置，濾過， 濾液減壓回收乙醇，濃縮至60°C條件下相對密度為1. 15~1. 30的清膏；
[0028] e、將清膏與清膏重30-40%的微晶纖維素混合，置60°C -80°C條件下減壓干燥，得 干膏；
[0029] f、將干膏和揮發(fā)油包合物粉碎成細(xì)粉，與清膏重5-55%的微晶纖維素和干膏重 〇. 5%硬脂酸鎂混合均勻，得細(xì)粉。
[0030] 所述的中風(fēng)后遺癥表現(xiàn)為半身不遂，肢體無力，口舌歪斜，言語謇澀，智能減退，口 角流涎。
[0031] 上述含有靈芝和銀杏葉的中藥組合物在制備益氣養(yǎng)陰活血、化痰通絡(luò)醒腦的藥物 中應(yīng)用，其中，該組合物由以下重量份的組分制成：
[0032] 靈芝300-400重量份銀杏葉300-400重量份淮牛膝200-290重量份
[0033] 玄參200-290重量份石昌蒲150-190重量份天麻 100-140重量份。
[0034] 上述組合物優(yōu)選由以下組分制成：
[0035] 靈芝300-350重量份銀杏葉300-350重量份淮牛膝250-290重量份
[0036] 玄參250-290重量份石昌蒲150-180重量份天麻 110-140重量份。
[0037] 上述組合物最優(yōu)選由以下組分制成：
[0038] 靈芝333重量份銀杏葉333重量份淮牛膝278重量份
[0039] 玄參278重量份石菖蒲167重量份天麻 125重量份。
[0040] 與現(xiàn)有技術(shù)比較本發(fā)明的有益效果：
[0041] 本發(fā)明含靈芝和銀杏葉的中藥組合物治療給藥對大鼠大腦中動脈閉塞再灌注所 致腦損傷具有顯著的的保護(hù)作用；對于治療大鼠大腦中動脈閉塞所致永久性腦缺血具有顯 著的保護(hù)作用；對PAF、ADP誘導(dǎo)家兔血小板聚集有顯著的抑制作用；對血栓形成具有顯著 的抑制作用；能顯著延長小鼠出血時間和凝血時間。
[0042] 另外，本發(fā)明中藥組合物能對連二亞硫酸鈉（Na2S204)合并缺糖致體外皮層神經(jīng) 元細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型起到很好的保護(hù)作用；能對血小板活化因子（PAF)致皮層神經(jīng)元 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的保護(hù)作用明顯。本發(fā)明中藥組合物含藥血清治療給藥對體外培養(yǎng) 皮層神經(jīng)元具有顯著的保護(hù)作用。
[0043] 以下通過試驗(yàn)例對中風(fēng)后促進(jìn)康復(fù)進(jìn)行具體說明。采用的試驗(yàn)樣品簡稱復(fù)方銀靈 通膠囊，通過實(shí)施例1方法制備得到。
[0044] 一、試驗(yàn)材料
[0045] 1、藥品與試劑
[0046] 受試藥名稱：復(fù)方銀靈通膠囊：性狀：棕色粉末（按照實(shí)施例方法制備得到）， 人用量：成人服用生藥材量：18. 168g，6. Og浸膏粉末/人.d \每克浸膏粉末相當(dāng)于生藥 3. 028g。配制方法：將受試藥用0. 5% CMC-Na研磨配制成所需濃度的均勻混懸液。
[0047] 銀杏葉片：揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：每片含總黃酮醇苷19. 2mg，萜類內(nèi)酯 4. 8mg，批號：12053121。藥物配制：臨用前用0. 5% CMC-Na研磨配制成所需濃度的均勻混 懸液。
[0048] 阿司匹林腸溶片：拜耳醫(yī)藥保健有限公司，規(guī)格：100mg，臨用前用0. 5% CMC-Na研 磨配制成所需濃度的均勻混懸液。
[0049] 水合氯醛：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，臨用前用0. 9%氯化鈉注射液配制成濃 度為3%的溶液。
[0050] 紅四氮唑（TTC)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，臨用前稱取TTC粉末，用磷酸鹽緩 沖液溶解配制成1 %的TTC溶液。
[0051] 甲醛溶液：A. R，西隴化工股份有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：500ml/瓶，批號：1005152。
[0052] 血小板活化因子（PAF) :SIGMA公司產(chǎn)品。
[0053] 配制：①取PAFlmg，置于2.6ml氯化鈉注射液中使溶解，分裝于具塞密封管中 0.1 ml/支，-20°C保存，臨用前以氯化鈉注射液100倍稀釋備用（濃度為7. 072 μ mol/L)。② 取PAF 5mg，用DMSO溶解配制為母液，-20°C保存。臨用前用滅菌PBS稀釋至所需濃度（作 用于神經(jīng)元的終濃度為40 μ mol/L) 〇
[0054] 5 '-腺苷二磷酸二鈉鹽（ADP) :SIGMA 公司，批號：YY1124B056W。
[0055] 配制：①取IOmg ADP，置6. 64ml 0· 9%氯化鈉注射液中，震蕩至完全溶解，先配成 3mmol/L的保存液，分裝于具塞密封管，0.1 ml/支，-20°C保存。臨用前以0. 9%氯化鈉注射 液稀釋10倍即可（濃度為300 μ mol/L)。②取400mg ADP，用生理鹽水配成20mg/ml的溶 液。
[0056] MEM培養(yǎng)基：美國GIBCO公司，批號：1133365。取MEM粉末溶于1000 ml滅菌三蒸 中，用NaHC03調(diào)pH值至7. 0,過濾除菌、分裝，4°C冰箱保存。使用前加入10%胎牛血清。
[0057] 無糖 EBSS (Earle' s balanced salt solution)緩沖液：稱取 NaCl 6. 8g、 NaHC032. 2g、KCl 0· 4g、CaCl2 ·2Η20 0· 265g、MgSO40.0 9767g、NaH2PO4O. 122g，溶于 1000ml 三 蒸水中，pH7. 2-7. 4,過濾除菌，4°C冰箱保存。
[0058] 含糖 EBSS 緩沖液：稱取 NaCl 6. 8g、NaHC032. 2g、KCl 0· 4g、CaCl2 · 2H20 0· 265g、 MgSO40.0 9767g、NaH2PO4O. 122g、葡萄糖 lg，溶于 1000ml 三蒸水中，pH7. 2-7. 4,過濾除菌， 4 °C冰箱保存。
[0059] 消化液：胰酶，BI0SHARP公司產(chǎn)品；胰酶用PBS配至0. 25%，過濾除菌；EDTA用PBS 配至0.02%，高壓滅菌。胰酶、EDTA 1 :1混合，4°C冰箱保存。
[0060] β -actin，山羊抗兔（抗小鼠）IgG，：北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
[0061] Syn 抗體，NF- κ B p65 抗體，NF- κ B pp65 抗體：Ι κ B α 抗體，ρ? κ B α 抗體均為 Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品。
[0062] 2、試驗(yàn)動物
[0063] 雄性清潔級SD大鼠，體重250~300g，蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供， 生產(chǎn)許可證號：SCXK (蘇）2009-0001 ;白色家兔，體重I. 8-2. 0kg，由南京市江寧區(qū)青龍山動 物繁殖場提供，動物生產(chǎn)許可證號=SCXK (蘇）2012-0008。
[0064] 二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果：
[0065] 1、復(fù)方銀靈通膠囊治療給藥對大鼠大腦中動脈閉塞再灌注所致腦損傷的保護(hù)作 用（第一天給藥3次，以后每天給藥一次，連續(xù)給藥14天）
[0066] I. 1對死亡率、神經(jīng)行為學(xué)評分、腦含水量、梗塞率的影響
[0067] 清潔級雄性SD大鼠105只，體重250_300g，采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞 (MCAO)模型 [1]。偽手術(shù)組大鼠除不插入線栓外，其他操作同模型組。造模后將動物分為7 組，每組15只，復(fù)方銀靈通膠囊3個劑量組，分別為：I. 2g/kg (0. 24g/ml)，0. 6g/kg (0. 12g/ ml)，0· 3g/kg(0· 06g/ml)。陽性對照藥銀杏葉提取物組4mg/kg(0· 8mg/ml)。另設(shè)偽手術(shù)組 及缺血模型對照組（均給以等容積的〇.5%CMC-Na)。于復(fù)灌后3h開始灌胃給藥，每天給 藥一次，總共給藥15天，首次給藥劑量為維持量的3倍。
[0068] 實(shí)驗(yàn)過程中觀察并記錄動物的死亡情況（死亡前癥狀和死亡數(shù)）。即記錄動物的 存活率。
[0069] 漁線的制備：將一長40mm，直徑0. 26mm的漁線的一端用記號筆標(biāo)記，在距離此標(biāo) 記端18_處用記號筆再做一標(biāo)記，置于生理鹽水中備用。
[0070] 于第一次給藥后0. 5h始，隔天參照神經(jīng)功能缺陷評分法（18分標(biāo)準(zhǔn)）對各組大鼠 進(jìn)行評分[2]，標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0071] 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)
[0072]
[0074] 上述指標(biāo)測定后，將大鼠麻醉，測腦溫，之后處死大鼠。取出大腦，迅速置于_20°C 速凍l〇-15min，至鼠腦變硬時，從額極2mm開始，做冠狀均切五刀，后方至大腦與后腦交 界處，切成2mm厚的六片后迅速將腦片置于適量1% TTC的磷酸緩沖溶液中[3]，避光溫孵 [4]，每隔7~8分鐘翻動一次，不時觀察腦片顏色變化，待紅色區(qū)鮮明顯現(xiàn)時取出腦片（約 30min)，用數(shù)碼相機(jī)拍照后輸入電腦，之后用Image pro plus計算梗塞區(qū)（白色）和兩半 腦體積，計算梗塞百分比如下：
[0075] 腦梗死體積百分比={[總梗死體積_(右半腦體積-左半腦體積）]/左半腦體 積} XlOO % ο
[0076] 將染色后的腦組織稱得大腦濕重，然后置于110°C烘箱烘干，對照大腦濕重求出腦 含水量如下 [5]:
[0077] 腦組織含水量（％) = (1-腦組織干重/腦組織濕重）X 100%
[0078] 結(jié)果見表1~表2。
[0079] 表1對局灶性腦缺血再灌注大鼠死亡率的影響（I土^
[0081 ] 各組死亡率如上表所示。隨銀靈通劑量升高，大鼠死亡率有逐漸降低的趨勢。
[0082] 表2對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響（:?士
[0085] #ρ〈0· 05, ##p〈0. 01 模型對照組 vs.偽手術(shù)組；*ρ〈0· 05, **p〈0.0 lvs.模型對照組； ap〈0. 05, aap〈0. 01銀靈通組vs.銀杏葉片組；bp〈0. 05, bbp〈0. 01銀靈通組vs.阿司匹林組
[0086] 由表2可見，偽手術(shù)組未見明顯的神經(jīng)行為學(xué)損傷。與偽手術(shù)組相比，模型組自 缺血后第一天開始，神經(jīng)行為學(xué)評分均極顯著性降低（p〈〇. 01)。與模型對照組相比，銀靈 通高劑量組能顯著性升高缺血再灌注后第8d大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分（p〈0. 05)，能極顯著性 升高缺血再灌注后第l〇d、12d、14d大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分（p〈0.01);銀靈通中劑量組能顯著 性升高缺血再灌注后12d大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分（p〈0. 05)，能極顯著性升高缺血再灌注后第 14d大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分（p〈0. 01)。銀靈通各劑量組與銀杏葉片組相比，銀靈通低劑量組 第14d神經(jīng)行為學(xué)評分顯著性降低（p〈0. 05)。
[0087] 表3對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦溫、梗塞百分比及腦組織含水量的影響(?)
[0089] #ρ〈0· 05, ##p〈0. 01 模型對照組 vs.偽手術(shù)組；*ρ〈0· 05, **p〈0