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含靈芝和銀杏葉的中藥組合物用于中風后促進康復的應用_5

文檔序號:9570696閱讀:來源:國知局
);與銀杏葉片組 相比,銀靈通低劑量組細胞存活率顯著性降低(P〈〇. 05);其他各組間比較無顯著性差異 (p>0. 05)。
[0291] LDH釋放測定
[0292] 表26銀靈通含藥血清預防給藥對PAF造模后細胞LDH漏出率的影響(i±s,n=3)
[0294] #p〈0. 05##p〈0. 01模型對照組與空白對照組比較;*p〈0. 05#p〈0. 01與模型對照組 比較;ap〈〇. 05,aap〈0. 01與銀杏葉片組比較;bp〈0. 05, bbp〈0. 01與阿司匹林組比較。
[0295] 由表26可見,與模型對照組相比,銀靈通高劑量組LDH漏出率極顯著性減少 (p〈0. 01),銀杏葉片組、銀靈通中劑量組LDH漏出率顯著性減少(p〈0. 05);其他各組間比較 無顯著性差異(P>〇. 05)。
[0296] LD含量測定
[0297] 表27銀靈通含藥血清預防給藥對PAF造模后細胞LD含量的影響(?? h=3)

[0300] #p〈0. 05##p〈0. 01模型對照組與空白對照組比較;*p〈0. 05#p〈0. 01與模型對照組 比較;ap〈〇. 05,aap〈0. 01與銀杏葉片組比較;bp〈0. 05, bbp〈0. 01與阿司匹林組比較。
[0301] 由表27可見,與模型對照組相比,銀杏葉片組、銀靈通高劑量組細胞LD含量極顯 著性降低(P〈〇. 01),銀靈通中劑量在細胞LD含量顯著性降低(p〈0. 05);其他各組間比較無 顯著性差異(P>〇. 05)。
[0302] SOD活力測定
[0303] 表28銀靈通含藥血清預防給藥對PAF造模后細胞SOD活力的影響(?? n=3)
[0305] #p〈0. 05##p〈0. 01模型對照組與空白對照組比較;*p〈0. 05#p〈0. 01與模型對照組 比較;ap〈〇. 05,aap〈0. 01與銀杏葉片組比較;bp〈0. 05, bbp〈0. 01與阿司匹林組比較。
[0306] 由表28可見,與模型組相比,銀杏葉片組、銀靈通高劑量組SOD活力極顯著性升 高(p〈0. 01),阿司匹林組、銀靈通中劑量組SOD活力顯著性升高(p〈0. 05);與銀杏葉片組相 比,銀靈通低劑量組SOD活力極顯著性降低(p〈0. 01);與阿司匹林組相比,銀靈通低劑量組 SOD活力顯著性降低(p〈0. 05);其他各組間比較無顯著性差異(p>0. 05)。
[0307] MDA含量測定
[0308] 表29銀靈通含藥血清預防給藥對PAF造模后細胞MDA含量的影響(1i±s, n=3)
[0309]
[0311] #p〈0. 05##p〈0. 01模型對照組與空白對照組比較;*p〈0. 05#p〈0. 01與模型對照組 比較;ap〈〇. 05,aap〈0. 01與銀杏葉片組比較;bp〈0. 05, bbp〈0. 01與阿司匹林組比較。
[0312] 由表29可見,與模型對照組相比,銀杏葉片組、銀靈通高劑量組MDA活力顯著性降 低(p〈0. 05);其他各組間比較無顯著性差異(p>0. 05)。
[0313] 7、復方銀靈通膠囊含藥血清治療給藥對體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元的保護作用-機理 研究
[0314] 7. 1大鼠含藥血清制備
[0315] 同 6.1。
[0316] 7. 2皮層神經(jīng)元細胞原代培養(yǎng)
[0317] 同 6. 2。
[0318] 7. 3實驗模型制備方法
[0319] 7. 3. 1連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)合并缺糖致皮層神經(jīng)元細胞缺氧缺糖損傷模型(治 療給藥) [26]
[0320] 參照文獻,在無糖EBSS溶液中加入終濃度為IOmM的連亞二硫酸鈉(Na2S 2O4)干粉 充分溶解,用NaHCOJl pH為7. 2,即為缺氧溶液。
[0321] 取培養(yǎng)于24孔板生長良好的皮層神經(jīng)元細胞用于試驗,棄去原培養(yǎng)液,用含糖的 EBSS溶液輕輕蕩洗兩遍,換成含有終濃度為IOmM的Na2S2O4的無糖EBSS溶液(空白對照 組加入含糖的EBSS),同時用醫(yī)用膠布將板四周封住,孵育Ih后換去缺氧培養(yǎng)液,用含糖的 EBSS溶液輕輕蕩洗兩次,換成正常含B-27的Neurobasal培養(yǎng)液,同時加入各組血清,置 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h??瞻讓φ战M(Control)加入占總體積10%的空白對 照組血清、模型對照組(Vehicle)加入占總體積15%的空白對照組血清、復方銀靈通膠囊 高劑量組(銀靈通-H)加入占總體積15%的銀靈通含藥血清、中劑量組(銀靈通-M)加入 占總體積10%的銀靈通含藥血清+5%空白對照組血清、低劑量組(銀靈通-L)加入占總體 積5%的銀靈通含藥血清+10%空白對照組血清,陽性對照銀杏葉片組(銀杏葉片)加入占 總體積15%的銀杏葉片組含藥血清,阿司匹林組(ASP)加入占總體積15%的阿司匹林含藥 血清,每個組別設3個復孔,實驗重復3次。
[0322] 觀察指標測定:
[0323] MTT法測定細胞活力,LDH釋放及SOD、MDA活力測定均按照常規(guī)方法。
[0324] 7. 3. 2血小板活化因子(PAF)致皮層神經(jīng)元細胞損傷模型[27]
[0325] 取培養(yǎng)于24孔板生長良好的皮層神經(jīng)元細胞用于試驗,棄去原培養(yǎng)液,用PBS輕 輕蕩洗兩次,加入新鮮培養(yǎng)液及終濃度為4X 10 5M的PAF,置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù) 培養(yǎng)。3h后加入各組含藥血清。設空白對照組(加入占總體積15%的空白對照組血清)、 模型對照組(加入占總體積15%的空白對照組血清)和復方銀靈通膠囊高(加入占總體 積15%的銀靈通含藥血清)、中(加入占總體積10%的銀靈通含藥血清+5%空白對照組血 清)、低(加入占總體積5%的銀靈通含藥血清+10%空白對照組血清)劑量組,陽性對照銀 杏葉片組(加入占總體積15%的銀杏葉片組含藥血清),置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培 養(yǎng)24h,每個劑量設3個復孔,實驗重復3次。
[0326] 指標觀察測定:
[0327] MTT法測定細胞活力:LDH釋放及SOD、MDA活力測定均按照常規(guī)方法。
[0328] 對PAF誘導的體外神經(jīng)元損傷NF- κ B信號轉(zhuǎn)導通路的研究:
[0329] 采用6孔板進行神經(jīng)元培養(yǎng),PAF造模結(jié)束加入含藥血清24h后,用PBS蕩洗細胞 培養(yǎng)板兩次,加入適量〇. 125%胰酶邊消化邊用移液槍吹打至下層細胞漂浮,加入微量胎牛 血清終止消化,同組合并轉(zhuǎn)移至I. 5ml離心管中,2000rpm離心10min,倒掉消化液保留下層 細胞,加適量RIPA裂解液(含PMSF ImM)渦旋混勻,然后于冰浴中裂解30min,每隔5min渦 旋混勾,4°C,12000rpm離心5min,分離出上清,BCA法進行蛋白定量,測定上清液體積,加入 5XSDS上樣緩沖液后沸水煮沸5min,分裝后于-80°C保存。配制4%濃度聚丙烯酰胺濃縮 膠和10%濃度聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)分離膠進行電泳,按20yg蛋白的溶液體積上樣。待 所需目的蛋白處MARK充分分離后停止電泳。參照MARK的分子量指示,切割出含目的蛋白 的PAGE膠,與預先用甲醇活化的PVDF膜一起做成"三明治"形狀,其排列依次為:海綿/濾 紙/膠/膜/濾紙/海綿。濕法轉(zhuǎn)膜,在IOOmA恒流下進行電轉(zhuǎn)2小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取下 PVDF膜,封閉液封閉Ih以消除非特異背景。TBST洗掉封閉液,一抗4°C孵育過夜。用TBST 室溫下蕩洗三次,每次lOmin。二抗室溫下孵育2h后,TBST蕩洗三次,每次lOmin。滴加適 量Ecl顯色液,用凝膠成像儀對膜進行曝光拍照,用Quantity one圖像處理軟件分析目標 條帶的凈光密度值。實驗重復三次。
[0330] 7. 4實驗結(jié)果
[0331] 7. 4. 1復方銀靈通膠囊含藥血清治療給藥對連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)合并缺糖致 皮層神經(jīng)元細胞缺氧缺糖損傷模型的影響
[0332] 表30銀靈通治療給藥對連二亞硫酸鈉所致的神經(jīng)元損傷中細胞存活率的影響 (平均值土s.d.,n = 3)

[0335] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01模型對照與空白對照組比較;*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01與模型對照 組比較。
[0336] 皮層神經(jīng)元細胞經(jīng)Na2S2O4*理后加入含藥血清約24h后,倒置顯微鏡下觀察:正 常對照組細胞形態(tài)細長、透明度高、光澤較好;模型組細胞損傷明顯。損傷的皮層神經(jīng)元細 胞與正常細胞相比,細胞突起消失,腫脹,折光度減弱胞,胞質(zhì)圓縮、脫落。加入復方銀靈通 含藥血清的細胞與損傷細胞相比則形態(tài)明顯改善,較多細胞保留突起結(jié)構(gòu),腫脹細胞減少, 而且細胞有光澤。
[0337] 由表30可見,與模型對照組相比,銀靈通-H組和銀杏葉片組都能對0⑶造成的體 外神經(jīng)元損傷起到很好的保護作用(P〈〇. 01),銀靈通-M也能顯著性提高神經(jīng)元在OGD后的 存活率(p〈〇. 05)。
[0338] 表31銀靈通治療給藥對連二亞硫酸鈉所致神經(jīng)元損傷中LDH漏出率、SOD及MDA 活力的影響(平均值土 s. d.,η = 3)
[0340] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01模型對照與空白對照組比較;*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01與模型對照 組比較。
[0341] 由表31可見,與模型對照組相比,銀靈通高劑量組能極顯著性降低0⑶造模后細 胞上清液中LDH漏出率(ρ〈0. 01),銀靈通中劑量組能顯著性降低LDH漏出率(ρ〈0. 05)。表 明銀靈通能很好地減輕OGD導致的細胞損傷。銀靈通高劑量組能極顯著性降低OGD導致的 體外神經(jīng)元MDA活力的增高,降低脂質(zhì)過氧化損傷。
[0342] 0⑶造模后,SOD活力極顯著性降低(ρ〈0. 01),表明神經(jīng)元的抗氧化系統(tǒng)遭到嚴重 破壞,而銀靈通高劑量組能顯著性地升高神經(jīng)元O⑶損傷后SOD活力(p〈0. 05),起到良好的 抗氧化損傷作用。
[0343] 表32銀靈通治療給藥對PAF所誘導的體外神經(jīng)元損傷中細胞存活率的影響(平 均值土 s. d.,η = 3)
[0345] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01模型對照與空白對照組比較;*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01與模型對照 組比較。
[0346] PAF造模后加入含藥血清處理約24h后,倒置顯微鏡(10 X 10倍)下觀察,正常 對照組細胞形態(tài)細長、透明度高、光澤較好;模型組細胞損傷明顯。損傷的皮層神經(jīng)元細 胞與正常細胞相比,細胞突起消失,腫脹,折光度減弱胞,胞質(zhì)圓縮、脫落。加入復方銀靈 通含藥血清進保護的細胞與損傷細胞相比則形態(tài)明顯改善,較多細胞保留突起結(jié)構(gòu),腫脹 細胞減少,而且細胞有光澤。由MTT結(jié)果可見,銀靈通高劑量組細胞存活率極顯著性升高 (p〈0. 01),銀靈通中劑量組細胞存活率顯著性升高(p〈0. 05)。
[0347] 表33銀靈通治療給藥對PAF所誘導的體外神經(jīng)元損傷中LDH漏出率、SOD及MDA 活力的影響(平均值土 s. d.,η = 3)
[0349] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01模型對照與空白對照組比較;*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01與模型對照 組比較。
[0350] 由表33可見,與模型對照組相比,銀靈通高劑量組細胞上清中LDH漏出率顯著性 下降(p〈0. 05),銀靈通中劑量組LDH漏出率也顯著性下降(p〈0. 05)。
[0351] 由表33可見,與模型對照組相比,銀靈通高劑量組、中劑量組、銀杏葉片組MDA活 力顯著性降低(p〈〇. 05),銀靈通高劑量組SOD活力極顯著性升高(p〈0. 01),銀靈通中劑量 組神經(jīng)元SOD活力顯著性升高(ρ〈0· 05)。
[0352] 表34銀靈通對PAF誘導的體外神經(jīng)元損傷中NF-κ B信號轉(zhuǎn)導通路的影響(平均 值土 s. d.,η = 3)
[0354] #ρ〈(λ 05, ##ρ〈(λ 01模型對照與空白對照組比較;*ρ〈(λ 05, #ρ〈(λ 01與模型對照 組比較。
[0355] 如表34可見,銀靈通高劑量組能極顯著性地抑制PAF誘導的ρ65和ρρ65表達的 升高(ρ〈0. 01),銀靈通中劑量組也能起到顯著的作用(ρ〈0. 05)。此外,銀靈通還能抑制 I κ B α磷酸化蛋白的表達。由此可見,銀靈通可通過阻止ρ65和I κ B α的磷酸化來抑制 PAF誘導的NF- κ B信號通路的激活。
[0356] 由表34可見,經(jīng)PAF損傷后,體外神經(jīng)元細胞Syn的表達量極顯著性降低 (ρ〈0. 01),表明該條件下,神經(jīng)元細胞遭受了非常嚴重的損傷。而銀靈通對體外神經(jīng)元Syn 表達量的影響與體內(nèi)結(jié)果一致,與模型對照組相比,銀靈通高劑量組能極顯著性增加 Syn 的表達量(Ρ〈〇. 01),銀靈通中劑量組也能極顯著性地增加 Syn的表達量(ρ〈0. 01),對PAF 誘導的體外神經(jīng)元損傷起到很好的保護作用。
【具體實施方式】 [0357] 實施例1
[0358] 1、配方:
[0359] 靈芝333g銀杏葉333g淮牛膝278g
[0360] 玄參278g石菖蒲167g天麻 125g
[0361] 2、制備方法:
[0362] (一)粉碎:將石菖蒲粉碎成顆粒,備用。
[0363] (二)CO2超臨界萃?。喝∈牌杨w粒于萃取釜中,CO2超臨界萃取,其中壓力為 30Mpa,萃取釜溫度為60°C,萃取時間為1. 5小時,得揮發(fā)油和石菖蒲萃余物,備用。
[0364] (三)揮發(fā)油包合:取揮發(fā)油用等體積的乙醇溶解,得揮發(fā)油乙醇溶液,備用;另取 揮發(fā)油重量4倍量的β -環(huán)糊精,用β -環(huán)糊精4倍量的水研勻,倒入膠體磨中,緩慢連續(xù)滴 加上述揮發(fā)油乙醇溶液,碾磨包合20分鐘,傾出,0-4 °C冷藏靜置24小時以上,濾過,于40 °C 真空干燥,即得揮發(fā)油包合物,備用;
[0365] (四)醇提:靈芝、銀杏葉、淮牛膝、玄參和天麻、以及石菖蒲萃余物加入處方總藥 材8倍重量濃度為90 %的乙醇,加熱回流提取兩次,每次1. 5小時,提取液合并,靜置,濾過, 濾液減壓回收乙醇,濃縮至60°C條件下相對密度為1. 15~1. 30的清膏,測定干膏率,備用。
[0366] (五)混合干燥:將清膏與清膏重30-40%的微晶纖維素混合,置真空干燥箱60°C 條件下減壓干燥,得干霄備用。
[0367] (六)粉碎、混合、膠囊填充:將干膏、環(huán)糊精包合物置萬能粉碎機中粉碎成細粉, 與剩余微晶纖維素和干膏重〇. 5 %的硬脂酸鎂混合均勻,得細粉。其中,步驟五和步驟六共 用微晶纖維素總量與清膏的重量比例為237. 5 :260。
[0368] (七)膠囊填充:取0號硬膠囊填充,裝量:0· 5g。
[0369] 參考文獻
[0370] [1JNAGAKANNAN P, SHIVASHARAN B DjTHIPPESffAMY B S, et
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