骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腸神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失或障礙的神經(jīng)修復(fù)材料中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及神經(jīng)修復(fù)材料領(lǐng)域，具體地指一種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腸神經(jīng) 系統(tǒng)功能缺失或障礙的神經(jīng)修復(fù)材料中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸神經(jīng)系統(tǒng)（entericnervoussystem，ENS)是外周神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，它在消化 系統(tǒng)的多項基本生理功能，如胃腸道運(yùn)動、消化吸收、分泌及血流中，發(fā)揮重要調(diào)控作用。特 別的，ENS對消化道功能的調(diào)節(jié)具有相對獨(dú)立性，能在脫離中樞的條件下對器官實施局部整 合，因而也被稱為"腸腦"。
[0003] 多種因素，包括基因、藥物（刺激性瀉劑）、炎癥以及年齡的老齡化等可引起ENS 的損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)變性、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失；神經(jīng)遞質(zhì)合成、含量、分泌異常及其受體系統(tǒng)表 達(dá)上調(diào)或下調(diào)最終導(dǎo)致胃腸道運(yùn)動、感覺、分泌功能紊亂等。ENS功能的異常或退化可以引 起先天性腸神經(jīng)系統(tǒng)動力障礙，如先天性巨結(jié)腸，同樣亦能夠引起多種后天消化道運(yùn)動功 能障礙疾病，包括賁門失弛緩癥、胃食管反流病、胃排空延遲、糖尿病胃輕癱以及便秘等。這 類疾病發(fā)病率高，癥狀頑固，反復(fù)出現(xiàn)，嚴(yán)重影響病患的生活質(zhì)量。由于胃腸道生理功能調(diào) 控的復(fù)雜性，腸神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性變引起的胃腸功能紊亂相關(guān)疾病目前尚缺乏有效的 治療手段。
[0004] 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bonemarrowstromalcells,BMSC)是來源于中胚層具有自我 更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。相較于其它干細(xì)胞，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞自身具有良 好的易獲得、易分離、易擴(kuò)增、易修飾、特別是免疫赦免的特性，而在基因工程領(lǐng)域受到關(guān) 注。比如，神經(jīng)干細(xì)胞雖被報道對神經(jīng)損傷具有一定的修復(fù)作用，但由于其難獲得，移植排 斥反應(yīng)導(dǎo)致移植細(xì)胞局部存活率低、移植后表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記物的細(xì)胞是否真具有神經(jīng)細(xì)胞的 功能、遠(yuǎn)期效果不確定等諸多問題尚有待解決。目前BMSC在ENS損傷修復(fù)中的作用尚未見 報道。不同的研究團(tuán)隊關(guān)于BMSC對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)效果及機(jī)制的研究結(jié)果也參差 不齊，各有爭議。干細(xì)胞的干預(yù)條件不同是導(dǎo)致修復(fù)結(jié)果不同的重要原因。BMSC的多向潛 能性也就導(dǎo)致了其可塑性，如何選擇最適合的預(yù)處理條件、修復(fù)條件將對于有效提高BMSC 神經(jīng)損傷的修復(fù)效率有重要意義。目前對于BMSC在ENS損傷中最佳修復(fù)條件的探索尚未 見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的針對ENS功能障礙相關(guān)疾病還沒有形成有效治療體系的缺陷，提供 了一種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腸神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失或障礙的神經(jīng)修復(fù)材料中的應(yīng)用。 它將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bonemarrowstromalcells,BMSC)和含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng) 營養(yǎng)因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF)的胎腸培養(yǎng)基（fetal gutconditionmedium，F(xiàn)GCM)共同培養(yǎng)預(yù)處理，得到神經(jīng)修復(fù)材料，并將神經(jīng)修復(fù)材料注 入患病受體內(nèi)，從而促進(jìn)消化道腸神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)再生和胃腸動力的恢復(fù)。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腸神經(jīng)系統(tǒng)功能 缺失或障礙的神經(jīng)修復(fù)材料中的應(yīng)用。
[0007] 為實現(xiàn)上述應(yīng)用過程，本發(fā)明還提供了一種用于治療腸神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失或障 礙的神經(jīng)修復(fù)材料，它的原料是由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblastgrowthfactor,BFGF)的DMEM低糖液體培養(yǎng)基和含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神 經(jīng)營養(yǎng)因子的胎腸培養(yǎng)基組成，其中，所述DMEM低糖液體培養(yǎng)基的配方為1000mg/L的葡 萄糖，15 %的胎牛血清，2mmol/L的L-谷氨酰胺，110mg/L的丙酮酸鈉，100U/ml青霉素和 100μg/ml鏈霉素；
[0008] 所述胎腸培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)取胚胎發(fā)育15天的SD孕鼠，45mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射常規(guī)麻醉大鼠； [0010] 2)無菌條件下取出8~10條胎腸，用無Ca2+，Mg2+的PBS清洗2~3次；
[0011] 3)再用lmg/mL的膠原酶常溫消化15min;
[0012] 4)PBS洗2次，反復(fù)吹打研磨，加入含有20μg/mL纖連蛋白的DMEM低糖液體培養(yǎng) 基，并接種于培養(yǎng)瓶中；
[0013] 5) 3天后收集培養(yǎng)液，84g離心5min，取上清過濾，即得到FGCM原培養(yǎng)基；
[0014] 6)使用時，將FGCM原培養(yǎng)基與DMEM低糖液體培養(yǎng)基按體積比1 : 1混合，并調(diào)整 pH值為7. 4,即得到胎腸培養(yǎng)基。
[0015] 作為優(yōu)選方案，所述DMEM低糖液體培養(yǎng)基中堿性成纖維細(xì)胞生長因子的含量為 6~16ng/mL,最優(yōu)選為：堿性成纖維細(xì)胞生長因子的含量為10ng/mL;胎腸培養(yǎng)基中神 經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量為8~14ng/mL，最優(yōu)選為：神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量為 10ng/mL〇
[0016] 作為優(yōu)選方案，所述骨髓基質(zhì)干細(xì)胞含量是約1.OX106個/mL。
[0017] 上述神經(jīng)修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟：
[0018] 1)首先將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞置于含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子的DMEM低糖液體培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)12~36h;得到培養(yǎng)物；最佳培養(yǎng)時間為24h;
[0019] 2)將步驟1)得到培養(yǎng)物置于含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的胎腸培養(yǎng)基 中培養(yǎng)10~15d，最佳培養(yǎng)時間為10d，得到神經(jīng)修復(fù)材料；其中，每3天更換培養(yǎng)基。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0021] 1)本發(fā)明的神經(jīng)修復(fù)材料用于治療腸神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失或障礙，該神經(jīng)修復(fù)材料 是由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bonemarrowstromalcells,BMSC)、含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (basicfibroblastgrowthfactor，BFGF)的DMEM低糖液體培養(yǎng)基和含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源 性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF)的胎腸培養(yǎng)基（FGCM)共同培養(yǎng)預(yù)處理，得到神經(jīng)修復(fù)材料注入患 病受體內(nèi)，從而促進(jìn)消化道腸神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)再生和胃腸動力的恢復(fù)。說明經(jīng)過預(yù)處理 的BMSC可以用于ENS功能缺失或障礙相關(guān)疾病的治療。
[0022] 2)本發(fā)明神經(jīng)修復(fù)材料中共同培養(yǎng)（預(yù)處理）的BMSC可以導(dǎo)致有效神經(jīng)再生，沒 有經(jīng)過培養(yǎng)預(yù)處理的BMSC沒有發(fā)現(xiàn)有效神經(jīng)再生現(xiàn)象。體內(nèi)外實驗表明BMSC可能通過影 響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子正反饋機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)再生。
[0023] 3)本發(fā)明制備神經(jīng)修復(fù)材料的方法提供了一種治療胃腸道腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病的手 段，該方法可以有效地運(yùn)用于其它神經(jīng)損傷相關(guān)疾病修復(fù)的應(yīng)用中。
【附圖說明】
[0024] 圖1為BMSC培養(yǎng)鑒定圖
[0025] 圖lA(a~f)為BMSC培養(yǎng)圖：a_c為第一代BMSC按時間培養(yǎng)（第1天、第3天， 第7天）的細(xì)胞觀察圖；d-f為第二代（P2)、第四代（P4)、第六代（P6)培養(yǎng)的細(xì)胞觀察圖；
[0026] 圖1B為BMSC流式鑒定圖；
[0027] 圖1C為第六代（未處理）BMSC表面表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物的免疫熒光圖，其中縱 坐標(biāo)的中文含義為未處理的BMSC;
[0028] 圖2為BMSC分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的染色圖
[0029]圖中，圖A為脂肪細(xì)胞（Adipocytes)、
[0030] 圖B為骨細(xì)胞（Osteoblasts)、
[0031] 圖C為軟骨細(xì)胞（Chondrocytes);
[0032] 圖3為經(jīng)過預(yù)處理后的BMSC表現(xiàn)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的免疫熒光圖
[0033] 其中，圖A~C為經(jīng)過神經(jīng)修復(fù)材料處理后BMSC表面表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物 (PGP9. 5,NSE,Tujl,HuC/D，nNOS)的熒光圖，
[0034] 圖D為對照組（未處理）BMSC表面表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物的熒光圖，
[0035] 圖E-Ι表示為經(jīng)神經(jīng)修復(fù)材料處理后表面陽性表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物BMSC的百分 比（縱坐標(biāo)為神經(jīng)細(xì)胞表面標(biāo)記物PGP9. 5,NSE，Tujl，HuC/D，nNOS及其陽性表達(dá)的百分 比）；
[0036] 圖4為胃幽門部去神經(jīng)支配動物模型建立圖
[0037] 圖中，圖A為胃部解剖結(jié)構(gòu)示意圖；
[0038] 圖B為觀察假手術(shù)組（SHAM)和0. 5%BAC處理胃幽門部去神經(jīng)后PGP9. 5陽性神 經(jīng)細(xì)胞含量的組化圖；
[0039] 圖C為從蛋白質(zhì)印跡法驗證使用0. 5%BAC處理胃幽門部去神經(jīng)支配動物后幽門 部組織神經(jīng)細(xì)胞表面標(biāo)記物PGP9. 5表達(dá)含量的條帶，并用柱狀圖表示相對表達(dá)量，縱坐標(biāo) 的中文為相對的PGP9. 5含量水平；
[0040] 圖5為不同濃度BAC處理胃幽門部去神經(jīng)支配動物模型免疫組化圖
[0041] 圖中，圖A為假手術(shù)組（對照組；Sham);
[0042] 圖B為0. 1 %BAC處理胃幽門部去神經(jīng)后神經(jīng)元表面標(biāo)記物PGP9. 5表達(dá)含量圖；
[0043] 圖C為0. 3 %濃度BAC處理胃幽門部去神經(jīng)后神經(jīng)元表面標(biāo)記物PGP9. 5表達(dá)含量 圖；
[0044] 圖D為0. 5 %濃度BAC處理胃幽門部去神經(jīng)后神經(jīng)元表面標(biāo)記物PGP9. 5表達(dá)含量 圖；圖E-Η是A-D圖片相對應(yīng)的放大圖；
[0045] 圖6為神經(jīng)修復(fù)材料注入胃部后在胃部分布的熒光觀察圖
[0046] 圖中，圖A為注入后第1天，第7天，神經(jīng)修復(fù)材料以及對照組（SHAM)的BMSC在 胃中的分布情況；
[0047] 圖B-a為移植后第28天，神經(jīng)修復(fù)材料在胃中的分布情況；B-b為再生的神經(jīng)元 表面表達(dá)PGP9. 5含量圖；B-c，d和f說明大部分注入的神經(jīng)修復(fù)材料在胃黏膜下層并表達(dá) 神經(jīng)元表面標(biāo)記物PGP9. 5 ;
[0048] 圖B-d，e說明神經(jīng)元表面標(biāo)記物PGP9. 5陰性的神經(jīng)修復(fù)材料分布在黏膜層；圖 B-e，f，g是圖d中矩形的放大圖；
[0049] 圖7為神經(jīng)修復(fù)材料的注入導(dǎo)致大量胃幽門部神經(jīng)元再生的熒光圖
[0050] 圖中，圖A為注入神經(jīng)修復(fù)材料的去神經(jīng)支配大鼠模型