撬掉玻璃板，小心剝落分離膠，根據(jù)上樣標(biāo)本及目的蛋白位置進(jìn)行切 害J，膜材料為硝酸纖維素膜（NC膜），按照"海綿一3層濾紙一凝膠一NC膜一3層濾紙一海 綿"的順序裝置，注意小心趕出層面間的氣泡。將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，使夾子黑面對應(yīng)槽的 黑面。轉(zhuǎn)膜條件一般設(shè)置為恒電流200mA，電泳50min，電泳槽邊放置冰水混合物以降溫。
[0265] 2.43免疫反應(yīng)
[0266] 1)用TBS將NC膜浸濕后，移至含封閉液的平皿中，于室溫下?lián)u床上搖動封閉lh;
[0267] 2)將膜放入含TBST稀釋的一抗大小與膜相似的塑料袋中，封口，搖床上搖動孵育 lh，置4°C冰箱孵育過夜；
[0268] 3)次日將NC膜室溫下?lián)u床上復(fù)溫30min，用TBST搖床上搖動洗滌3次，每次 lOmin；
[0269] 4)將膜放入含TBST稀釋的相對應(yīng)的二抗的大小與膜相似的塑料袋中，封口，搖床 上搖動孵育lh;
[0270] 5)將膜取出，TBST搖床上搖動洗滌3次，每次lOmin。
[0271] 2. 44化學(xué)發(fā)光，顯影，定影
[0272] 1)將A和B兩種顯色底物按照1 : 1的體積比例混勻，將NC膜置于底物混合液中 充分接觸lmin，然后將膜移至另一塑料袋中，去盡殘留底物混合液，趕盡氣泡，包好后，放入 暗室X-光片中；
[0273] 2)視信號強弱曝光一定時間后，打開X-光片夾，將X-光片迅速浸入顯影液中，出 現(xiàn)明顯條帶后，即終止顯影；
[0274] 3)顯影完畢，將X-光片迅速浸入定影液中，定影時間一般約5min，定影完畢后，自 來水沖洗干凈X-光片，室溫下晾干。
[0275] 2.45凝膠圖象分析
[0276] 將所得膠片進(jìn)行掃描，凝膠圖像處理軟件Quantity-one分析各目的條帶光密度 值。
[0277] 3、免疫組化實驗
[0278] 1)焙片：將載玻片放入烤箱中，60min，60°C;
[0279] 2)室溫冷卻載玻片；
[0280] 3)脫蠟：二甲苯浸洗2次，每次15min;
[0281] 4)水化：梯度乙醇水化，100% -85% -75%，每次5min;
[0282] 5)蒸餾水浸洗3次，每次5min;
[0283] 6)抗原修復(fù)：玻片浸泡于0.lmm〇L/L、pH= 6. 0枸櫞酸修復(fù)液中，保鮮膜覆蓋，微 波爐高中低檔各加熱5min，室溫冷卻10~20min，補液，上述步驟循環(huán)4次；
[0284] 7)PBS洗5min*3次；8)封閉：1 %驢血清封閉30min，室溫；
[0285] 9)孵育一抗：1%BSA配制一抗，37°Clh，或者4°C過夜（放于濕盒內(nèi)，以防干燥）；
[0286] 10)第二天將玻片從冰箱中取出，室溫復(fù)溫30min;
[0287] 11)PBS洗 5min*3 次；
[0288] 12)孵育二抗：1 %BSA配制HRP-二抗，37°C30min(放于濕盒內(nèi)），
[0289] 13)?83洗511^11*3次；14)048顯色：配制048顯色液4、8、(：液各一滴（避光），現(xiàn) 用現(xiàn)配，滴加至玻片組織上，顯微鏡下觀察染色程度，及時用蒸餾水終止染色；
[0290] 15)蘇木精復(fù)染1下，用水沖洗；
[0291] 16) 1 %鹽酸酒精浸泡4秒，蒸餾水泡5min;
[0292] 17)脫水：梯度酒精脫水75% - 85%- 100%，各3分鐘；
[0293] 18)透明：將玻片放入二甲苯透明，觀察組織透亮，無氣泡；
[0294] 19)中性樹膠封片。
[0295] 滴加適量中性樹脂于玻片上，蓋上蓋玻片，避免氣泡出現(xiàn)。
[0296] 4.免疫熒光實驗
[0297] 1)冰凍切片室溫晾干15分鐘；
[0298] 2)PBS洗 5minX3 ;
[0299] 3)0. 1%TritonX-100 破膜并 15%BSA室溫封閉 60min;
[0300] 4)PBS洗 5minX3 ;
[0301] 5)分別滴加一抗（稀釋比例按相應(yīng)抗體說明書），室溫?fù)u床60min;
[0302] 6)切片置于濕盒內(nèi)，4°C過夜；
[0303] 7)第二天切片復(fù)溫60min;
[0304] 8)PBS洗 5minX3 ;
[0305] 9)分別滴加二抗（稀釋比例按相應(yīng)抗體說明書），室溫?fù)u床60min;
[0306] 10)PBS洗 5minX3 ;
[0307] 11)染核：1μg/mlHoechst33342 染色lOmin;
[0308] 12)卩85洗511^11\3;
[0309] 13)熒光淬滅劑封片；
[0310] 14)熒光共聚焦顯微鏡下觀察或-20°C避光保存與熒光結(jié)果一致。（圖6和圖7)， WB檢測結(jié)果顯示（圖7C)，與假手術(shù)組相比，注入神經(jīng)修復(fù)材料的去神經(jīng)支配大鼠幽門部位 的神經(jīng)元標(biāo)記物（PGP9. 5，NSE，Tujl)和一種主要的腸神經(jīng)遞質(zhì)（nNOS)表達(dá)顯著升高3倍 以上。
[0311] 由上可知，經(jīng)過神經(jīng)修復(fù)材料注入后可使多種神經(jīng)元標(biāo)記物顯著升高。
[0312] 熒光結(jié)果顯示，在注入未經(jīng)預(yù)處理的BMSC的大鼠中，未能觀察到明顯的神經(jīng)元再 生（圖9)。WB結(jié)果也顯示：未經(jīng)預(yù)處理的BMSC注入去神經(jīng)支配的大鼠后與預(yù)處理組相比， 這些神經(jīng)元標(biāo)記表達(dá)幾乎沒有改變（圖12)。
[0313] 由上可知，未經(jīng)預(yù)處理的BMSC注入后不能誘導(dǎo)有效ENS神經(jīng)元再生。
[0314] 作為神經(jīng)生長因子，⑶NF在ENS的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了很重要的作用。將BMSC 打入大鼠體內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性⑶NF的表達(dá)存在一個潛在的正反饋機制（圖13)。BMSC可 以內(nèi)源性地表達(dá)低水平的⑶NF蛋白，然而，人為加入外源性⑶NF以后，發(fā)現(xiàn)BMSC中內(nèi)源性 的⑶NF表達(dá)顯著升高（圖14A，B)。此外，注入BMSC的大鼠與對照組的大鼠相比，可產(chǎn)生 一種持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)的⑶NF，長達(dá)28天之久。
[0315] 由上可知，在體內(nèi)外實驗中均可觀察到BMSC的"⑶NF正反饋"現(xiàn)象，這一現(xiàn)象可能 是預(yù)處理后的BMSCs作為一種神經(jīng)修復(fù)材料高效導(dǎo)致神經(jīng)再生的重要原因。
[0316] 其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實施例對本發(fā)明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據(jù)本實施例在不經(jīng) 創(chuàng)造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腸神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失或障礙的神經(jīng)修復(fù)材料中的 應(yīng)用。2. -種用于治療腸神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失或障礙的神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于：它的原料 是由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子BFGF的DMEM低糖液體培養(yǎng)基和含有 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的胎腸培養(yǎng)基組成，其中，所述骨髓基質(zhì)干細(xì)胞含量是約 1. 0X105~7個/mL〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于：所述胎腸培養(yǎng)基的制備方法，包 括以下步驟： 1) 取胚胎發(fā)育15天的SD孕鼠，45mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射常規(guī)麻醉大鼠； 2) 無菌條件下取出8~10條胎腸，用無Ca2+，Mg2+的PBS清洗2~3次； 3) 再用lmg/mL的膠原酶常溫消化15min; 4. PBS洗2次，反復(fù)吹打研磨，加入含有20μg/mL纖連蛋白的DMEM低糖液體培養(yǎng)基，并 接種于培養(yǎng)瓶中； 5) 3天后收集培養(yǎng)液，84g離心5min，取上清過濾，即得到FGCM原培養(yǎng)基； 6) 使用時，將FGCM原培養(yǎng)基與DMEM低糖液體培養(yǎng)基按體積比1 : 1混合，并調(diào)整pH 值為7. 4,即得到胎腸培養(yǎng)基。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于：所述DMHM低糖液體培養(yǎng)基的 配方1000mg/L的葡萄糖，15%的胎牛血清，2mmol/L的L-谷氨酰胺，110mg/L的丙酮酸鈉， 100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于：所述DMEM低糖液體培 養(yǎng)基中堿性成纖維細(xì)胞生長因子的含量為6~16ng/ML。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于：最優(yōu)選為：堿性成纖維細(xì)胞生長 因子的含量為10ng/mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于：所述胎腸液體培養(yǎng)基 中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量為8~14ng/mL。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于：所述胎腸液體培養(yǎng)基中神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量為10ng/mL。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于：所述骨髓基質(zhì)干細(xì)胞含量 是約 1. 0X106個/mL。10. -種權(quán)利要求2所述神經(jīng)修復(fù)材料的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 首先將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞置于含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子的DMEM低糖液體培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)12~36h;得到培養(yǎng)物； 2) 將步驟1)得到培養(yǎng)物置于含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的胎腸液體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)10~15d;得到神經(jīng)修復(fù)材料；其中，每3天更換培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腸神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失或障礙的神經(jīng)修復(fù)材料中的應(yīng)用。神經(jīng)修復(fù)材料的原料是由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子的DMEM低糖液體培養(yǎng)基和含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的胎腸培養(yǎng)基組成，其制備方法是首先將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞置于含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子的DMEM低糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到培養(yǎng)物；然后將培養(yǎng)物置于含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的胎腸液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；得到神經(jīng)修復(fù)材料。將神經(jīng)修復(fù)材料注入患病受體內(nèi)，從而促進(jìn)消化道腸神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)再生和胃腸動力的恢復(fù)。
【IPC分類】A61L27/54, A61L27/38
【公開號】CN105363072
【申請?zhí)枴緾N201510495593
【發(fā)明人】侯曉華, 李緒行, 藺蓉
【申請人】華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年8月13日