的水凝膠。 支撐材料的示例性用途
[0132] 在一些實(shí)施方案中，支撐材料用作構(gòu)造生物構(gòu)建體(例如細(xì)胞構(gòu)建體、組織、器官 等)的構(gòu)建單元。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，支撐材料單元用來(lái)限定和保持期望的構(gòu)建體的缺 乏細(xì)胞材料的域（即，中間細(xì)胞單元）。在一些實(shí)施方案中，支撐材料能夠采用任何形狀或大 小。
[0133] 例如，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可加熱NovoGel?溶液(最初為與緩沖液和水混合的粉末 相）W降低其粘度，并將其吸入到具有所需尺寸的微量移液器中（或通過(guò)活塞的負(fù)位移進(jìn)入 所需形狀的室中）。可冷卻移液器(或室）中的NovoGel?溶液至室溫，例如通過(guò)對(duì)移液器(或 室）外部進(jìn)行強(qiáng)制風(fēng)冷或?qū)⑽⒘恳埔浩鞑迦牒欣湟后w的容器中，W便其可W凝固成具有 所需形狀的凝膠，即支撐材料。得到的支撐材料可在特定細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官的構(gòu)建期 間從移液器或室分配。參見(jiàn)例如圖4。
[0134] 在一些實(shí)施方案中，使用支撐材料來(lái)提高工程化組織或器官在生物打印后的存活 能力。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，支撐材料提供了組織或器官與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基之間穿過(guò)臨時(shí)或 半永久的限制材料(例如支撐材料)柵格的直接接觸。在一些實(shí)施方案中，組織被限制在多 孔或有間隙的材料中。該組織或器官的至少一些細(xì)胞直接獲取養(yǎng)分提高了該組織或器官的 存活能力。
[0135] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法包括另外的和任選的用于提高工程化組 織或器官存活能力的步驟，包括：1)任選地在放置凝聚的多細(xì)胞聚集體之前分配限制材料 (例如支撐材料）的基底層;2)任選地分配限制材料的周界;3)在限定的幾何形狀內(nèi)生物打 印組織的細(xì)胞;和4似在限制材料中引入間隙的圖案(例如柵格、篩網(wǎng)或網(wǎng)格），分配限制材 料的伸長(zhǎng)體(例如圓柱體、帶狀物等），覆蓋初生的組織。
[0136] 在一些實(shí)施方案中，覆蓋圖案的間隙均勻或基本均勻地分布在組織或器官的表面 周?chē)?。在其它?shí)施方案中，間隙不均勻地分布，因而組織或器官的細(xì)胞不均勻地暴露于養(yǎng) 分。在不均勻的實(shí)施方案中，可利用存在差異的養(yǎng)分獲取性來(lái)影響組織或器官的一種或多 種性能。例如，可能期望使生物打印的細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官的一個(gè)表面上的細(xì)胞比另一 表面上的細(xì)胞增殖得更快。在一些實(shí)施方案中，組織或器官的各個(gè)部分對(duì)養(yǎng)分的暴露可在 不同的時(shí)間變化，W影響組織或器官朝期望的終點(diǎn)的發(fā)育。
[0137] 在一些實(shí)施方案中，在任何合適的時(shí)間移除限制材料，包括但不限于在生物打印 后立即（例如在10分鐘內(nèi)）、在生物打印后(例如在10分鐘后）、在細(xì)胞彼此基本凝聚前、在細(xì) 胞彼此基本凝聚后、在細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)前、在細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)后、恰在使用前，等 等。在各種實(shí)施方案中，通過(guò)任何合適的方法移除限制材料。例如，在一些實(shí)施方案中，限制 材料被切除、脫離細(xì)胞、消化或溶解。 用于校準(zhǔn)生物打印機(jī)墨盒位置的方法和系統(tǒng)
[0138] 在某些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)了用于制造組織和器官的生物打印機(jī)。在一些實(shí)施 方案中，接附到生物打印機(jī)上的墨盒包含生物墨水和/或支撐材料。在一些實(shí)施方案中，生 物打印機(jī)W特定圖案在特定位置沉積生物墨水或支撐材料，W形成特定的細(xì)胞構(gòu)建體。在 一些實(shí)施方案中，包含生物墨水的墨盒是一次性的。在一些實(shí)施方案中，墨盒在擠出、分配 或沉積內(nèi)容物之后從生物打印機(jī)上退出。在一些實(shí)施方案中，新的墨盒接附到生物打印機(jī) 上。
[0139] 為了制造復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，本文公開(kāi)的生物打印機(jī)W合適的可重復(fù)精度從墨盒分配生 物墨水和/或支撐材料。在各種實(shí)施方案中，合適的可重復(fù)精度包括任意軸上約±5、10、20、 30、40或50WI1的精度。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的生物打印機(jī)W約±20wii的可重復(fù)精度 從墨盒分配生物墨水和/或支撐材料。但是，在一些實(shí)施方案中，由于墨盒的移除和插入，打 印機(jī)頭（因此墨盒)相對(duì)于組織構(gòu)建體的位置發(fā)生變化。因此，對(duì)于精確地校準(zhǔn)打印機(jī)頭、墨 盒和分配孔口相對(duì)于打印機(jī)臺(tái)、接收表面、組織或器官的位置的方法，存在需求。
[0140] 在一些實(shí)施方案中，校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的方法包括使用至少一道激光。在進(jìn)一步 的實(shí)施方案中，校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的方法包括使用第一和第二激光。
[0141] 在一些實(shí)施方案中，校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的方法包括手動(dòng)(例如目視)校準(zhǔn)。
[0142] 在一些實(shí)施方案中，校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的方法包括手動(dòng)校準(zhǔn)和激光校準(zhǔn)。
[0143] 在一些實(shí)施方案中，沿一個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。 在一些實(shí)施方案中，沿兩個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。在一些實(shí) 施方案中，沿=個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。
[0144] 在一些實(shí)施方案中，利用至少一道激光進(jìn)行校準(zhǔn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，利用第 一和第二激光進(jìn)行校準(zhǔn)。 使用水平激光進(jìn)行校準(zhǔn)的方法
[0145] 在某些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)了校準(zhǔn)包含分配孔口的打印機(jī)頭的位置的方法。在 一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法進(jìn)一步包括激發(fā)激光并生成至少一道基本穩(wěn)定和/或基 本靜止的激光束，并且其中所述激光束與地面平行。參見(jiàn)圖1。
[0146] 在一些實(shí)施方案中，該方法包括沿至少一個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置，其中該軸選自X 軸、y軸和Z軸。在一些實(shí)施方案中，該方法包括沿至少兩個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置，其中該軸 選自X軸、y軸和Z軸。在一些實(shí)施方案中，該方法包括沿至少=個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置，其中 該軸選自X軸、y軸和Z軸。在一些實(shí)施方案中，該方法包括(a)沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置；（b) 沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置;和/或(C)沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置;其中各軸對(duì)應(yīng)于笛卡爾坐標(biāo) 系中同名的軸。在一些實(shí)施方案中，利用至少一道激光進(jìn)行校準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，利用 第一和第二激光進(jìn)行校準(zhǔn)。
[0147] 在一些實(shí)施方案中，沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)定位打印機(jī)頭，使得打印機(jī) 頭(i)位于第一y卦限且(ii)分配孔口低于激光束的上闊限；（b)向激光束移動(dòng)打印機(jī)頭，并 且在激光束被打印機(jī)頭中斷時(shí)立即停止所述移動(dòng)，其中激光束被打印機(jī)頭中斷的位置是第 一y位置；（C)重新定位打印機(jī)頭，使得打印機(jī)頭位于第二y卦限且分配孔口低于激光束的上 闊限；（d)向激光束移動(dòng)打印機(jī)頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時(shí)立即停止所述移動(dòng)，其 中激光束被中斷的位置是第二y位置;（e)并計(jì)算第一y位置和第二y位置之間的中點(diǎn)。
[0148] 在一些實(shí)施方案中，沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)將打印機(jī)頭定位(i)在第一 y位置和第二y位置之間的中點(diǎn)且（ii)在激光的傳感器閥限W外；和(b)向傳感器閥限移動(dòng) 打印機(jī)頭，并且在打印機(jī)頭接觸傳感器閥限時(shí)立即停止所述移動(dòng);其中打印機(jī)頭接觸傳感 器的位置加上半個(gè)打印機(jī)頭寬度為X位置。
[0149] 在一些實(shí)施方案中，沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)定位打印機(jī)頭，使得激光束 可測(cè)量打印機(jī)頭的一側(cè)的精確位置；（b)定位打印機(jī)頭，使得激光束可測(cè)量打印機(jī)頭的對(duì)側(cè) 的精確位置；（C)并相對(duì)于每次測(cè)量過(guò)程中的激光位置和測(cè)量的距離，計(jì)算打印機(jī)頭的中點(diǎn) 位置。
[0150] 在一些實(shí)施方案中，沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)定位打印機(jī)頭，使得激光束 可測(cè)量打印機(jī)頭的一側(cè)的精確位置；（b)定位打印機(jī)頭，使得激光束可測(cè)量打印機(jī)頭的對(duì)側(cè) 的精確位置；（C)并相對(duì)于每次測(cè)量過(guò)程中的激光位置和測(cè)量的距離，計(jì)算打印機(jī)頭的中點(diǎn) 位置。
[0151] 在一些實(shí)施方案中，沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)定位打印機(jī)頭，使得分配孔 口位于激光束上方;和(b)向激光束移動(dòng)打印機(jī)頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時(shí)立即停 止所述移動(dòng)，其中激光束被中斷的位置是Z位置。 使用垂直激光進(jìn)行校準(zhǔn)的方法
[0152] 在某些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)了校準(zhǔn)包含分配孔口的打印機(jī)頭的位置的方法。在 一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法進(jìn)一步包括激發(fā)激光并生成至少一道基本穩(wěn)定和/或基 本靜止的激光束，并且其中所述激光束與地面垂直。參見(jiàn)圖2。
[0153] 在一些實(shí)施方案中，該方法包括沿至少一個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選 自X軸、y軸和Z軸。在一些實(shí)施方案中，該方法包括沿至少兩個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中 該軸選自X軸、y軸和Z軸。在一些實(shí)施方案中，該方法包括沿至少=個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位 置，其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。
[0154] 在一些實(shí)施方案中，該方法包括(a)沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置；（b)沿X軸校準(zhǔn)打 印機(jī)頭的位置;和(C)沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置;其中各軸對(duì)應(yīng)于笛卡爾坐標(biāo)系中的同名 軸。
[0155] 在一些實(shí)施方案中，沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)定位打印機(jī)頭，使得打印機(jī) 頭（i)位于第一y卦限且（ii)分配孔口在激光的傳感器閥限W外；（b)向激光束移動(dòng)打印機(jī) 頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時(shí)立即停止所述移動(dòng)，其中激光束被打印機(jī)頭中斷的位 置是第一y位置；（C)重新定位打印機(jī)頭，使得打印機(jī)頭位于第二y卦限且分配孔口在激光的 傳感器閥限W外；（d)向激光束移動(dòng)打印機(jī)頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時(shí)立即停止所 述移動(dòng)，其中激光束被中斷的位置是第二y位置；（e)并計(jì)算第一y位置和第二y位置之間的 中點(diǎn)。
[0156] 在一些實(shí)施方案中，沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)將打印機(jī)頭定位(i)在第一 y位置和第二y位置之間的中點(diǎn)，且（ii)在激光的傳感器閥限W外；和(b)向傳感器閥限移動(dòng) 打印機(jī)頭，并且在打印機(jī)頭接觸傳感器閥限時(shí)立即停止所述移動(dòng);其中打印機(jī)頭接觸傳感 器的位置加上半個(gè)打印機(jī)頭寬度為X位置。
[0157] 在一些實(shí)施方案中，沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)定位打印機(jī)頭，使得分配孔 口位于激光束上方，使得其恰在激光傳感器范圍閥限W外；和(b)降低打印機(jī)頭，直至達(dá)到 傳感器閥限，其中達(dá)到激光傳感器閥限的位置是Z位置。在一些實(shí)施方案中，在打印機(jī)頭的 多個(gè)點(diǎn)重復(fù)步驟(a)和(b)，并對(duì)測(cè)量的高度取平均值，W確定Z位置。
[0158] 在一些實(shí)施方案中，沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括：（a)定位打印機(jī)頭，使得激光束 可W測(cè)量打印機(jī)頭底部上的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)的精確位置；（b)基于該激光位置和已知的測(cè)量 的距離，計(jì)算打印機(jī)頭的絕對(duì)或平均位置。 使用垂直和水平激光進(jìn)行校準(zhǔn)的方法
[0159] 在某些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)了校準(zhǔn)包含分配孔口的打印機(jī)頭的位置的方法，其 中打印機(jī)頭接附在生物打印機(jī)上，該方法包括沿至少一個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該 軸選自X軸、y軸和Z軸。在一些實(shí)施方案中，該方法包括沿至少兩個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置， 其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。在一些實(shí)施方案中，該方法包括沿至少=個(gè)軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭 的位置，其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。
[0160] 在一些實(shí)施方案中，該方法包括(a)沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置；（b)沿X軸校準(zhǔn)打 印機(jī)頭的位置;和(C)沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置;其中各軸對(duì)應(yīng)于笛卡爾坐標(biāo)系中的同名 軸。
[0161 ]在一些實(shí)施方案中，校準(zhǔn)包括使用第一激光和第二激光。在一些實(shí)施方案中，第一 激光是垂直的激光，而第二激光是水平的激光。 使用激光進(jìn)行校準(zhǔn)的系統(tǒng)
[0162] 在某些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)了用于校準(zhǔn)包含沉積孔口的墨盒的位置的系統(tǒng)，其 中墨盒接附在生物打印機(jī)上，所述系統(tǒng)包含：用于沿至少一個(gè)軸校準(zhǔn)墨盒位置的手段，其中 該軸選自y軸、X軸和Z軸。
[0163] 在某些實(shí)施方案中，本文還公開(kāi)了用于校準(zhǔn)包含分配孔口的打印機(jī)頭的位置的系 統(tǒng)，其中打印機(jī)頭接附在生物打印機(jī)上，所述系統(tǒng)包含：用于沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的手 段;用于沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的手段;和用于沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的手段。
[0164] 在一些實(shí)施方案中，用于校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的系統(tǒng)包含用于沿X軸、y軸和Z軸校準(zhǔn) 打印機(jī)頭的手段。在一些實(shí)施方案中，用于沿X軸、y軸和Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的手段是激光準(zhǔn) 直、光學(xué)準(zhǔn)直、機(jī)械準(zhǔn)直、壓電準(zhǔn)直、磁力準(zhǔn)直、電場(chǎng)或電容準(zhǔn)直、超聲準(zhǔn)直或其組合。
[0165] 在一些實(shí)施方案中，用于校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的系統(tǒng)包含用于沿X軸、y軸和Z軸校準(zhǔn) 打印機(jī)頭的手段。在一些實(shí)施方案中，用于沿X軸、y軸和Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的手段是激光準(zhǔn) 直。在一些實(shí)施方案中，激光準(zhǔn)直手段包含至少一道激光。在一些實(shí)施方案中，激光準(zhǔn)直手 段包含多道激光。
[0166] 在一些實(shí)施方案中，激光準(zhǔn)直意味著其具有任何合適的精度。在各種實(shí)施方案中， 合適的精度包括任意軸上約±5、10、20、30、40或50皿的精度。在一些實(shí)施方案中，激光準(zhǔn)直 手段精確到垂直軸上± 40um和水平軸上± 20um。
[0167] 在一些實(shí)施方案中，在激光源和測(cè)量點(diǎn)之間的激光路徑未中斷。在一些實(shí)施方案 中，通過(guò)使用反射表面或光學(xué)透鏡，激光路徑改變了最多179°。在一些實(shí)施方案中，激光路 徑改變了90°。在一些實(shí)施方案中，使用水平激光束，通過(guò)利用反射表面偏轉(zhuǎn)，在垂直路徑上 進(jìn)行測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，使用垂直激光束，通過(guò)利用反射表面偏轉(zhuǎn)，在水平路徑上進(jìn) 行測(cè)量。 實(shí)施例
[0168] W下具體實(shí)施例僅應(yīng)解釋為說(shuō)明性的，并且不W任何方式限制本公開(kāi)內(nèi)容的其余 部分。無(wú)需進(jìn)一步詳述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可W基于本文的描述最大程度地利用本發(fā)明。 本文引用的所有出版物特此通過(guò)引用全文并入。其引用證明了此類信息的可用性和公開(kāi)傳 播。 實(shí)施例1: HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體 細(xì)胞培養(yǎng)
[0169] 平滑肌細(xì)胞:使原代人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞化ASMC)在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)、 lOOU/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素、0.25iig/ml兩性霉素 B、0.01M肥PES (全部來(lái)自 Invi trogen Co;rp.，Car 1 sbad，CA)、50mg/L脯氨酸、50mg/L甘氨酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗 壞血酸和化g/L CuS化(全部來(lái)自Sigma,St丄OUiS,MO)的低葡萄糖Du化ecco改良eagle培養(yǎng) 基(DMEM; Invi trogen Corp .，CarIsbad，CA)中于37°C和5 %C〇2下保持和擴(kuò)充。在所有研究 中使用第4代至第8代的HASMC的鋪滿培養(yǎng)物。
[0170] 內(nèi)皮細(xì)胞:使原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)在補(bǔ)充有2 %FBS，化g/ml氨化可的松、 lOng/ml人表皮生長(zhǎng)因子、3ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、lOiig/ml肝素、lOOU/ml青霉素， 0.1 mg/ml鏈霉素和0.25iig/ml兩性霉素 B(全部來(lái)自Invi化Ogen Co巧.，Carlsbad ,CA)的培 養(yǎng)基200中保持和擴(kuò)充。細(xì)胞在37°C和5%C02下在經(jīng)明膠（來(lái)自豬血清；Sigma, St丄OUis, MO)包被的組織培養(yǎng)基處理的培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)。在所有研究中使用第4傳至第8代的HAEC的鋪 滿培養(yǎng)物。 NovoGe 1? 模具
[0171 ] 2%w/v NovoGel?溶液的制備：將Ig低烙點(diǎn)NovoGel?在50ml Du化ecco憐酸鹽緩 沖鹽水(DPBS)中溶解。簡(jiǎn)言之，在加熱板上將DPBS和NovoGel?加熱到85°C，持續(xù)攬拌直到 NovoGel?完全溶解。通過(guò)在125°C下蒸汽滅菌25分鐘對(duì)NovoGel?溶液進(jìn)行滅菌。只要溫度 保持在66.5°C W上，NovoGel?溶液就停留在液相。低于運(yùn)一溫度則發(fā)生相變，NovoGel?溶 液的粘度增加，且NovoGel?形成固體凝膠。
[0172] NovoGel?模具的制備:使用適合IOcm培養(yǎng)皿的Teflon?模具，制造用于溫育細(xì)胞 圓柱體的NovoGel?模具。簡(jiǎn)言之，使用70%乙醇溶液對(duì)了模具進(jìn)行預(yù)先滅菌，并使 模具經(jīng)受紫外線照射45分鐘。將滅菌的模具放置在IOcm培養(yǎng)皿（VWR International UX， West Chester,PA)頂上并牢固接附。使運(yùn)一組裝件(Teflon?模具+培養(yǎng)皿)保持垂直，并將 45ml預(yù)溫?zé)岬臒o(wú)菌2%NovoGel?溶液倒入Teflon?模具和培養(yǎng)皿之間的空間中。然后將組 裝件在室溫下水平放置1小時(shí)，W使NovoGel?完全膠凝。膠凝后，移除Teflon?印模，并用 DPBS洗涂NoVOGe 1?模具兩次。然后向NoVOGe 1?模具添加17.5ml HASMC培養(yǎng)基。 HASMC-HAEC 圓柱體
[0173] HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體的制造:為了制備混合細(xì)胞圓柱體，單獨(dú)收集HASMC和 HAEC，然后W預(yù)定比例混合。簡(jiǎn)言之，從鋪滿培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基，并用DPBS(lml/5cm2生長(zhǎng) 區(qū)域)洗涂細(xì)胞。通過(guò)在膜蛋白酶（lml/15cm 2生長(zhǎng)區(qū)域)的存在下溫育10分鐘，使細(xì)胞從培 養(yǎng)瓶表面脫離。使用0.15 %膜蛋白酶使HASMC脫離，而使用0.1 %膜蛋白酶使HAEC脫離。溫育 后向瓶中添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(相對(duì)于膜蛋白酶體積的2X體積）。將細(xì)胞懸浮液在200g下離屯、 6分鐘，接著完全移除上清液。將細(xì)胞沉淀在各自的培養(yǎng)基中重懸，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn) 行計(jì)數(shù)。合并適當(dāng)體積的HASMC和HAEC，產(chǎn)生含有5、7.5、10、12.5和15%齡6(：(作為總細(xì)胞群 的％)的混合細(xì)胞懸浮液。將該混合細(xì)胞懸浮液在200g下離屯、5分鐘，接著完全移除上清液。 將混合細(xì)胞沉淀在6ml HASMC培養(yǎng)基中重懸，并將其轉(zhuǎn)移到20ml玻璃小瓶中，接著在37°C和 5%C02下在定軌搖床上于15化pm培養(yǎng)60分鐘。運(yùn)使得細(xì)胞彼此聚集并開(kāi)始細(xì)胞間粘附。培 養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml離屯、管中并在200g下離屯、5分鐘。移除上清液培養(yǎng)基后，將 細(xì)胞沉淀在40化1 HASMC培養(yǎng)基中重懸，并用移液器上下抽吸數(shù)次，W確保所有的細(xì)胞簇被 打碎。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到放置在15ml離屯、管內(nèi)的0.5ml微量離屯、管(microfuge tube)中， 接著在2000g下離屯、4分鐘，W形成高度密集且致密的細(xì)胞沉淀。吸去上清液培養(yǎng)基，并通過(guò) 抽吸將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管（OD 1.0mm,ID 0.5mm，L 75mm; Drummond Scientif ic Co .， 化oomall ,PA)中，W便產(chǎn)生長(zhǎng)度為50mm的細(xì)胞圓柱體。將毛細(xì)管內(nèi)部的細(xì)胞糊在37°C和5% 0)2下于HASMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)20分鐘。然后使用與毛細(xì)管一起提供的柱塞，將細(xì)胞圓柱體從 毛細(xì)管沉積到NovoGel?模具（用HASMC培養(yǎng)基覆蓋）的凹槽中。將細(xì)胞圓柱體在37°C和5% C〇2下培養(yǎng)24和48小時(shí)。 實(shí)施例2:多層血管 細(xì)胞培養(yǎng)
[0174] 平滑肌細(xì)胞:將原代人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞化ASMC; GIBC0)在補(bǔ)充有10 %胎牛血清 (FBS)、100U/ml青霉素、O.lmg/ml鏈霉素、0.2化g/ml兩性霉素 B、0.01M皿PES(全部來(lái)自 Invi trogen Co;rp.，Car 1 sbad，CA)、50mg/L脯氨酸、50mg/L甘氨酸、20mg/L丙氨酸、50