mg/L抗 壞血酸和化g/L CuS化(全部來自Sigma，St丄OUiS ,MO)的低葡萄糖du化ecco改良的eagle培 養(yǎng)基(DMEM)中于37°C和5%C02保持和擴充。在所有研究中使用第4代至第8代的HASMC的鋪 滿培養(yǎng)物。
[0175] 內皮細胞:將原代人主動脈內皮細胞(HAEC)在補充有2%FBS、化g/ml氨化可的松、 lOng/ml人表皮生長因子、3ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、lOiig/ml肝素、lOOU/ml青霉素、 0.1 mg/ml鏈霉素和0.25iig/ml兩性霉素 B(全部來自Invi化Ogen Co巧.，Carlsbad ,CA)的培 養(yǎng)基200中保持和擴充。使細胞在37°C和5 % C〇2下在經明膠(來自豬血清)包被的組織培養(yǎng) 基處理的培養(yǎng)瓶中生長。在所有研究中使用第4代至第8代的HAEC的鋪滿培養(yǎng)物。
[0176] 成纖維細胞:將原代人皮膚成纖維細胞化DF)在補充有2%FBS、liig/ml氨化可的 松、lOng/ml人表皮生長因子、3ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、1化g/ml肝素、lOOU/ml青霉 素和O.lmg/ml鏈霉素（全部來自Invi化Ogen Co巧.，Carlsbad,CA)的培養(yǎng)基106中于37°C和 5 % C〇2保持和擴充。在所有研究中使用第4代至第8代HDF的鋪滿培養(yǎng)物。 NovoGe 1?溶液和模具
[0177] 2 %和4 % (w/V)No VOGe 1 ?溶液的制備：將1 g或2g (分別對于2 %或4 % )低烙點 NovoGel?(超純LMP)在50ml Du化ecco憐酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中溶解。簡言之，在持續(xù)攬拌 下，將DPBS和NovoGel?在加熱板上加熱到85°C，直到NovoGel?完全溶解。通過在125°C下蒸 汽滅菌25分鐘對NovoGel?溶液進行滅菌。只要溫度保持在66.5°CW上，NovoGel?溶液就停 留在液相。低于運一溫度則發(fā)生相變，NovoGel?溶液的粘度增加，且NovoGel?形成固體凝 膠。
[0178] NovoGel?模具的制備:使用適合IOcm培養(yǎng)皿的了 efkm?模具，制造用于培養(yǎng)細胞 圓柱體的NovoGel?模具。簡言之，使用70%乙醇溶液對Tet'lon?模具進行預先滅菌，并使 模具經受紫外線照射45分鐘。將滅菌的模具放置在IOcm培養(yǎng)皿頂上并牢固接附。使運一組 裝件（Teflon?模具+培養(yǎng)皿）保持垂直，并將45ml預溫熱的無菌2%NovoGel?溶液倒入 Teflon?:模具和培養(yǎng)皿之間的空間中。然后將組裝件在室溫下水平放置1小時，W使 NovoGel?完全膠凝。膠凝后，移除Teflon?印模，并用DPBS洗涂NovoGel?模具兩次。然后， 向NovoGel?模具添加17.5ml HASMC培養(yǎng)基W便培養(yǎng)HASMC-HAEC混合細胞圓柱體，或者向 NoVOGe 1?模具添加17.5ml皿F培養(yǎng)基W便培養(yǎng)皿F細胞圓柱體。 細胞圓柱體
[0179] HASMC-HAEC混合細胞圓柱體的制造:為了制備混合細胞圓柱體，單獨收集HASMC和 HAEC，然后W預定比例混合。簡言之，從鋪滿培養(yǎng)瓶中移除培養(yǎng)基，用DPBS(lml/5cm2生長區(qū) 域)洗涂細胞。通過在膜蛋白酶（lml/15cm 2生長區(qū)域)的存在下溫育10分鐘，使細胞從培養(yǎng) 瓶表面脫離。使用0.15%膜蛋白酶使HASMC脫離，而使用0.1 %膜蛋白酶使HAEC脫離。溫育 后，向瓶中添加適當的培養(yǎng)基（相對于膜蛋白酶體積的2X體積）。使細胞懸浮液在200g下離 屯、6分鐘，接著完全移除上清液。使細胞沉淀在各自的培養(yǎng)基中重懸，并使用血細胞計數器 進行計數。合并適當體積的HASMC和HAEC，W產生含有15 % HAEC和剩余85 %的HASMC(作為總 細胞群的百分比）的混合細胞懸浮液。將該混合細胞懸浮液在200g下離屯、5分鐘，接著完全 移除上清液。使混合細胞沉淀在6ml HASMC培養(yǎng)基中重懸，并將其轉移到20ml玻璃小瓶中， 接著在37°C和5 % C〇2下在定軌搖床上于15化pm培養(yǎng)60分鐘。運使細胞彼此聚集并開始細胞 間粘附。培養(yǎng)后，將細胞懸浮液轉移到15ml離屯、管中，在200g下離屯、5分鐘。移除上清液培養(yǎng) 基后，使細胞沉淀在40化I HASMC培養(yǎng)基中重懸，用移液器上下抽吸數次，W確保所有的細 胞簇被打碎。將細胞懸浮液轉移到放置在15ml離屯、管內的0.5ml微量離屯、管中，接著在 2000g下離屯、4分鐘，W形成高度密集且致密的細胞沉淀。吸去上清液培養(yǎng)基，并通過抽吸將 細胞轉移到毛細管(OD 1.0mm JD 0.5mm，L 75mm)中，W便產生長度為50mm的細胞圓柱體。 將毛細管內部的細胞糊在37°C和5%C02下于HASMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)20分鐘。然后使用與毛細 管一起提供的柱塞，將細胞圓柱體從毛細管沉積到NovoGel?模具（用HASMC培養(yǎng)基覆蓋）的 凹槽中。將細胞圓柱體在37°C和5%C02下培養(yǎng)24小時。
[0180] HDF細胞圓柱體的制造:使用與制備HASMC-HAEC混合細胞圓柱體類似的方法制備 皿F圓柱體。簡言之，從鋪滿的HDF培養(yǎng)瓶中移除培養(yǎng)基，并用DPBS( ImVScm2生長區(qū)域)洗涂 細胞。通過在膜蛋白酶(0.1 % ; ImVlScm2生長區(qū)域)的存在下溫育10分鐘，使細胞從培養(yǎng)瓶 表面脫離。溫育后，向瓶中添加 HDF培養(yǎng)基(相對于膜蛋白酶體積的2X體積）。將細胞懸浮液 在200g下離屯、6分鐘，接著完全移除上清液。使細胞沉淀在6ml HDF培養(yǎng)基中重懸，并將其轉 移到20ml玻璃小瓶中，接著在37°C和5%C02下在定軌搖床上于15化pm培養(yǎng)75分鐘。培養(yǎng)后， 將細胞懸浮液轉移到15ml離屯、管中，并在200g下離屯、5分鐘。移除上清液培養(yǎng)基后，使細胞 沉淀在40化1皿F培養(yǎng)基中重懸，并用移液器上下抽吸數次，W確保所有的細胞簇被打碎。 將細胞懸浮液轉移到放置在15ml離屯、管內的0.5ml微量離屯、管中，接著在2000g下離屯、4分 鐘，W形成高度密集且致密的細胞沉淀。吸去上清液培養(yǎng)基，并通過抽吸將細胞轉移到毛細 管（OD 1.OmmJD 0.5mm，L 75mm)中，W便產生長度為50mm的細胞圓柱體。將毛細管內部的 細胞糊在37°C和5 % C〇2下在HDF培養(yǎng)基中培養(yǎng)20分鐘。然后將細胞圓柱體從毛細管沉積到 NovoGel?模具（用皿F培養(yǎng)基覆蓋)的凹槽中。將細胞圓柱體在37°C和5%C02下培養(yǎng)24小時。 多層血管的制造
[0181] NovoGel?基板的制備；通過將IOml預溫熱的（〉40°C)NovoGel?(2%w/v)分配到 IOcm培養(yǎng)皿中來制造 NovoGel?基板。分配后NovoGel?立即均勻擴散，從而覆蓋整個皿底并 形成均勻層。將培養(yǎng)皿在室溫下溫育20分鐘，W使NovoGel?完全膠凝。
[0182] 多層血管:使用皿F圓柱體和HASMC-HAEC混合細胞圓柱體制造由HDF外層和HASMC-HAEC內層組成的血管。采用如圖4中所示的幾何排列。簡言之，在24小時培養(yǎng)期結束時，將成 熟的皿F和HASMC-HAEC圓柱體吸回毛細管中并置于適當的培養(yǎng)基中直至進一步使用。由 NovoGel?棒組成的支撐結構如下制備:將預溫熱的2 % NovoGel?吸入到毛細管化=50mm) 中，并在冷PBS溶液(4°C)中快速冷卻。5cm長的膠凝的No voGe 1?圓柱體從毛細管放下(使用 柱塞），并且直接放倒在NovoGel?基板上。第二個NovoGel?圓柱體與第一個郵連，重復該過 程直至放置10個NovoGel?圓柱體，從而形成第一層。此時將20山PBS分配到NovoGel?圓柱 體上方W保持其濕潤。進一步將六個NovoGel?圓柱體在如圖4中所示的位置處放到第1層之 上(第2層）。然后在位置4、5和6放置S個HDF圓柱體，W完成第2層。分配各個HDF圓柱體后， 在放置的圓柱體的上方分配40iU皿F培養(yǎng)基，W幫助隨后的圓柱體的放置并防止細胞圓柱 體脫水。接下來放置第3層的NovoGel?圓柱體，緊接著在位置3和6放置HDF圓柱體。用HDF培 養(yǎng)基再潤濕該結構后，在位置4和5放倒HASMC-HAEC混合圓柱體。隨后，在細胞圓柱體的上方 分配40山HASMC培養(yǎng)基和40山皿F培養(yǎng)基。通過在位置1和7放置NoVOGe 1?圓柱體，在位置2 和6放置HDF圓柱體，在位置3和5放置HASMC-HAEC混合圓柱體，最后在位置4放置4 % NovoGel?圓柱體，完成第4層。類似地，通過在圖4中所示的位置放倒NovoGel?圓柱體接著 是皿F圓柱體最后是HASMC-HAEC圓柱體，完成第5、6和7層。一旦整個構建體完成，將0.5ml溫 熱的NovoGel?分配到該構建體的各端上，并使其在室溫下膠凝5分鐘。在該NovoGel?膠凝 后，向培養(yǎng)皿添加30ml HASMC培養(yǎng)基（W確保整個構建體完全浸沒）。將構建體在37°C和5% C〇2下培養(yǎng)24小時，W允許細胞圓柱體之間的融合。
[0183]在24小時結束時，從融合的多層血官移除周圍的NovoGel?支撐結構。 實施例3:生物打印機
[0184] 組裝生物打印機。生物打印機包含打印機頭，打印機頭具有用于夾持墨盒的筒夾 夾頭夾具和用于分配墨盒的內容物的活塞。使用的墨盒是長度為75-85mm的玻璃微毛細管。 每次需要生物墨水或支撐材料時，裝載新的毛細管。
[0185] 為了打印結構，在打印過程的持續(xù)期間，也就是在新的毛細管裝載到打印機頭中 時，需要±20wii的分配位置可重復性。為了保持所有裝載的毛細管在x、y和Z方向上相對于 同一點的可重復性，生物打印機包含用于校準微毛細管位置的激光校準系統(tǒng)。激光校準系 統(tǒng)將所有毛細管尖端的位置校準到共同參照位置。所有打印移動都是相對于運一參照位置 作出的。
[0186] 通過使用單激光測距傳感器，校準所有=個軸（x、y和Z軸）。該系統(tǒng)由激光傳感器 和激光束組成。傳感器閥限是激光傳感器的最大感應距離。傳感器設置為忽略比預定義的 閥限更遠的所有信號。傳感器使用=角測量來確定與對象(毛細管尖端）的距離。激光傳感 器定向為使光束垂直向上對準(+Z軸）。 垂直激光校準
[0187] 對于X軸上的校準:將毛細管尖端移動到激光傳感器的范圍中，尖端在激光束的左 偵U(-x)。將毛細管向+X方向移動，直到傳感器檢測到毛細管邊緣，并記錄運一位置。從對側 重復W上步驟(即，尖端放置在激光束右側(+X)并向-X方向移動，直到傳感器檢測到毛細管 邊緣）。對來自兩個步驟的位置取平均值，W計算毛細管的中點。任選地，對不同y位置重復 W上過程，并對計算的中點取平均值。
[0188] 對于y軸上的校準:對y軸重復W上(對于X軸的)程序。
[0189] 對于Z軸上的校準:毛細管尖端移動到傳感器束上方，使得該束擊中毛細管的底部 表面，且尖端恰在傳感器范圍閥限W外。降低毛細管，直至達到傳感器閥限，該位置記錄為Z 位置。任選地，在毛細管尖端表面上的多個點重復W上步驟，并對測量的高度取平均值。 水平激光校準
[0190] 對于y軸上的校準:移動毛細管，使得尖端恰低于激光束的高度，并且毛細管向一 側離開（Wy方向）。毛細管Wy方向朝向激光移動。當激光傳感器檢測到毛細管反射的束時， 停止毛細管并記錄運一位置。重復W上步驟，讓毛細管向激光的另一側離開，W-y方向移 動。將來自W上步驟的中點記錄為y位置。
[0191] 對于X軸上的校準:使用y軸上的校準結果，移動y軸，使得激光集中于毛細管上。移 動毛細管越過傳感器閥限，并向傳感器移動。在毛細管越過傳感器閥限且傳感器輸出發(fā)生 變化時，立即停止毛細管。將運一位置加上1/2毛細管寬度(來自y校準)記錄為X位置。
[0192] 對于Z軸上的校準:將毛細管從X位置上移，直至其擺脫激光束。毛細管尖端朝向激 光束下移，并且在激光束中斷時立即停止(使用與對于y軸相同的過程）。將運一位置記錄為 Z位置。 毛細管準備
[0193] 在從毛細管打印之前，準備好毛細管內部的生物墨水或支撐材料，使得生物墨水 或支撐材料將恰好在毛細管的尖端處開始打印。使用校準激光來準備毛細管。毛細管尖端 移動到恰在激光束上方，其中該束集中在y軸上。尖端在激光束上方20-100WI1處。向下驅動 打印機頭中的分配活塞，直至生物墨水或支撐材料開始從毛細管尖端向外分配并中斷激光 束。通過反向驅動活塞(20-100WI1)將分配的生物墨水或支撐材料吸回毛細管中。于是毛細 管被準備好W備分配。 NovoGel?毛細管清潔
[0194] NovoGel?用作支撐材料。為了除去粘在毛細管外表面上的過量NovoGel?并避免 過量的NovoGel?影響打印質量，除去過量的NovoGel?。將擦拭部件(wiping feature)集成 到散裝(bu化)NovoGel?容器中。散裝NovoGel?容器配備有標準醫(yī)療小瓶，該小瓶具有用于 接附隔膜的開蓋。隔膜配置為在l-2mm厚的硅膠的中屯、具有十字切口。通過將毛細管穿過隔 膜浸入散裝NovoGel?容器中并抽吸NovoGel?,在其離開容器時，將過量的NovoGel?從毛細 管上擦去，并留在散裝容器中。 血管結構的打印
[01M]如上所述組裝生物打印機和墨盒。生物打印機具有臺，該臺含有用于接收由生物 打印機生成的結構的培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿用NovoGe 1?包被。
[0196] 血管結構的二維表示形式(參見例如圖4)由用戶輸入到軟件程序中，進入與生物 打印機連接的計算機中。血管結構的二維表示形式由HASMC-HAEC混合細胞圓柱體、皿F圓柱 體的棒和限定了血管結構的空隙并圍繞血管結構的NovoGel?棒組成。HASMC-HAEC混合細胞 圓柱體和皿F細胞圓柱體如實施例1所述制備，并吸入毛細管中W供插入到打印機頭的筒夾 夾頭中?；蛘?，將毛細管裝載到打印機頭中并浸入散裝NovoGel?容器中，并將NovoGel?吸 到毛細管中。使用垂直激光校準系統(tǒng)來校準毛細管。
[0197] 當將來自軟件程序的命令提供給生物打印機時，生物打印機將在預定位置打印= 維結構(在HASMC-HAEC棒、皿F棒和No VoGe 1?棒之間交替巧Ij培養(yǎng)皿上。參見實施例2。將各個 棒放置到培養(yǎng)皿上之后，用少量培養(yǎng)基將棒潤濕。一旦整個構建體完成，將溫熱的NovoGel? 分配到構建體的各端上，使其在室溫下膠凝，并向培養(yǎng)皿添加細胞培養(yǎng)基W浸沒整個構建 體。然后將該構建體在37°C和5%C02下溫育，W促使細胞圓柱體之間的融合。在溫育時間結 束時，從融合的多層血管移除周圍的NovoGel?支撐結構。
[0198] 雖然本發(fā)明已結合其具體實施方案進行了描述，但應當理解，能夠對本發(fā)明的方 法作進一步修改。本專利申請旨在涵蓋本發(fā)明的任何變化、用途或改動，其一般遵循本發(fā)明 的原理并且包括與本公開內容相比的偏差，運些偏差在本發(fā)明所屬領域的已知或慣用實踐 范圍內，在闡述前可應用于本文中的基本特征，并且落在所附權利要求的范圍內。
【主權項】
1. 一種生物打印機，其包含： a. -個或多個打印機頭，其中每個打印機頭包含用于接收和夾持至少一個墨盒的手 段，并且其中每個墨盒包含沉積孔口和生物墨水，所述生物墨水包含固體或半固體組合物， 所述組合物包含活細胞； b. 用于分配選定的墨盒的生物墨水的手段，其通過應用壓力將選定的墨盒的生物墨水 通過沉積孔口擠出； c. 用于確定選定的墨盒在空間中的位置的手段;和 d. 用于調節(jié)所述生物墨水的分配的可編程的計算機處理器，所述處理器通信連接于所 述用于確定選定的墨盒的位置的手段和用于分配所述生物墨水的手段。2. 如權利要求1所述的生物打印機，其中所述用于分配選定的墨盒的生物墨水的手段 通過活塞、壓縮氣體、液壓技術或其組合應用壓力。3. 如權利要求1所述的生物打印機，進一步包含用于調節(jié)溫度的手段。4. 如權利要求3所述的生物打印機，進一步包含用于調節(jié)環(huán)境溫度、墨盒溫度、墨盒的 生物墨水溫度、接收表面溫度或其組合的手段。5. 如權利要求4所述的生物打印機，其中所述用于調節(jié)溫度的手段是加熱元件。6. 如權利要求5所述的生物打印機，其中所述用于調節(jié)溫度的手段是輻射加熱器、對流 加熱器、傳導加熱器、風扇加熱器、熱交換器或其組合。7. 如權利要求4所述的生物打印機，其中所述用于調節(jié)溫度的手段是冷卻元件。8. 如權利要求7所述的生物打印機，其中所述用于調節(jié)溫度的手段是冷卻劑容器、冷凍 液、冰、福射冷卻器、對流冷卻器、傳導冷卻器、風扇冷卻器或其組合。9. 如權利要求1所述的生物打印機，進一步包含用于向以下一種或多種應用潤濕劑的 手段： a. 打印機臺； b. 接收表面； c. 沉積孔口； d. 生物墨水； e. 支撐材料;和 f. 打印的構建體； 其中在一個或多個時間點應用潤濕劑，該時間點選自：通過生物打印機分配生物墨水 或支撐材料之前、與分配基本同時和通過生物打印機分配生物墨水或支撐材料之后。10. 如權利要求1所述的生物打印機，進一步包含接收表面，其用于接收從所述選定的 墨盒沉積的一個或多個結構，其中該接收表面是基本平坦或基本光滑的。11. 如權利要求1所述的生物打印機，進一步包含接收表面，其用于接收從所述選定的 墨盒沉積的一個或多個結構，其中該接收表面的形貌被設計為適應或影響一個或多個沉積 的結構的大小、形狀或紋理，或者幾何形狀。
【專利摘要】本文描述了生物打印機，其包含：一個或多個打印機頭，其中打印機頭包含用于接收和夾持至少一個墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含選自以下一種或多種的內容物：生物墨水和支撐材料；用于校準至少一個墨盒的位置的手段；和用于分配至少一個墨盒的內容物的手段。本文進一步描述了用于制造組織構建體的方法，包括：計算機模塊接收期望的組織構建體的視覺表示的輸入；計算機模塊生成一系列命令，其中該命令基于該視覺表示且可被生物打印機讀??；計算機模塊將該系列命令提供給生物打印機；和生物打印機按照該命令沉積生物墨水和支撐材料，以形成具有限定的幾何形狀的構建體。
【IPC分類】B41J3/407, A61F2/02
【公開號】CN105496601
【申請?zhí)枴緾N201510889413
【發(fā)明人】基思·墨菲, 斯科特·多爾夫曼, 內森·史密斯, 拉里·鮑文斯, 伊恩·索恩, 堤姆·麥克唐納, 克里斯·利-蘭開斯特, 理查德·金·洛
【申請人】奧加諾沃公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2011年9月27日
【公告號】CA2812766A1, CN103249567A, EP2629975A2, US8931880, US9149952, US9227339, US20120116568, US20140012407, US20150057786, US20160074558, WO2012054195A2, WO2012054195A3