拉帕酚f抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的用圖
【專利說明】拉帕酚F抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的用途
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013.05.07提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/820,542的優(yōu)先權(quán)，其公開 通過引用引入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 癌癥在美國(guó)和世界范圍內(nèi)仍然是主要的健康問題。在美國(guó)，2012年診斷出估計(jì)新 增超過150萬預(yù)計(jì)新的癌癥病例且癌癥患者中有577190名死于癌癥。癌癥造成的死亡占美 國(guó)全部死亡的近4/1。雖然增強(qiáng)的早期腫瘤診斷和管理顯著提高患者的存活率，但仍然需要 發(fā)展和發(fā)現(xiàn)新的抗癌療法，因?yàn)橛行┗颊邔?duì)目前的抗癌藥物表現(xiàn)出不敏感或治療一段時(shí)間 后出現(xiàn)抗藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法和組合物。如在本文中所用，術(shù)語 腫瘤細(xì)胞和癌細(xì)胞可互換使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腫瘤細(xì)胞為實(shí)體腫瘤細(xì)胞。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，所述腫瘤細(xì)胞為血癌細(xì)胞(血液腫瘤細(xì)胞）。一方面，所述組合物包括藥學(xué)上 可接受的載體中的拉帕酸F。一方面，所述方法包括向個(gè)體給藥包括治療有效量的拉帕酸F 的組合物。
【附圖說明】
[0005] 圖1:A.拉帕酚F的化學(xué)結(jié)構(gòu)。B和C.通過細(xì)胞菌落形成實(shí)驗(yàn)(B)證明的或相差顯微 鏡檢查(C)顯示的拉帕酚F抑制各種組織類型中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。所示細(xì)胞用拉帕酚F(50yM) 處理72小時(shí)或未用拉帕酚F(50yM)處理。D和E.3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮 唑溴化物(MTT)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示拉帕酚F以時(shí)間依賴性方式和劑量依賴性方式抑制不同癌 細(xì)胞株中的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。F和G.用拉帕酚F(50yM)對(duì)MCF10A非致癌性乳腺上皮細(xì)胞處理 3天(F)或6天(G)。處理后，收集細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)(G)或在相差顯微鏡(F)下拍攝照片。H.菌 落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示拉帕酚F通過A549(肺）、HCT116(結(jié)腸)和DU145(前列腺)腫瘤細(xì)胞抑 制菌落形成。I-N.MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示拉帕酚F抑制白血病細(xì)胞株、黑色素瘤細(xì)胞株和肉瘤 細(xì)胞株中的細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0006] 圖2:拉帕酚F誘導(dǎo)G1和G2細(xì)胞周期阻滯。（A)對(duì)用溶劑(DMS0)或拉帕酚F (50μΜ)處 理72小時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析。（Β)對(duì)用拉帕酚F(50yM)處理72小時(shí)的RK0 細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色。還顯示出有絲分裂細(xì)胞相對(duì)于總細(xì)胞的數(shù)量(有絲分裂指數(shù)，MI)。
[0007] 圖3:拉帕酚F對(duì)關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。A-D.用溶劑(DMS0)或拉帕酚F(50μ Μ)對(duì)指定細(xì)胞處理指定的時(shí)間且通過蛋白免疫印跡法分析不同的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的蛋 白表達(dá)。"C":溶劑處理的對(duì)照組。
[0008] 圖4:拉帕酚F對(duì)半胱天冬酶激活的影響。用溶劑(DMS0)或拉帕酚F(50yM)對(duì)指定細(xì) 胞處理指定的時(shí)間。使用指定的抗體通過蛋白免疫印跡法分析半胱天冬酶8、9和3(由半胱 天冬酶原水平的降低來表示)的激活。"C":溶劑處理的對(duì)照組。
[0009]圖5:p21在拉帕酚F-介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白B/CDK1下調(diào)和G2阻滯中的作用。（A和B) 對(duì)拉帕酸F未處理(DMS0)或處理(拉帕酸F)的p21-精通(p21-proficient)(親代的）和p21-缺陷（p21基因敲除）的HCT116細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期蛋白B和CDKl的蛋白表達(dá)分析(A);或在表 達(dá)靶向p21轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)不同區(qū)域的任意序列shRNA或P21-特異性shRNA的細(xì)胞中分析細(xì)胞周 期蛋白B和⑶K1的蛋白表達(dá)(B)<X和D.表達(dá)任意序列shRNAi或兩個(gè)不同的p21shRNA的RK0細(xì) 胞和MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。細(xì)胞未經(jīng)處理(DMS0)或用拉帕酚F(25yM)處理72小 時(shí)，并通過流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞周期譜圖。
[0010]圖6:拉帕酚F誘導(dǎo)野生型p53細(xì)胞和缺陷-p53的細(xì)胞中p21-啟動(dòng)子的激活。A和B MCF-7、MDA-MB-231和RK0細(xì)胞未經(jīng)處理或用拉帕酚F(50yM)處理48小時(shí);然后將細(xì)胞分成兩 部分;一部分用于通過Northern雜交分析p21mRNA表達(dá)(A)且另一部分用于通過蛋白免疫印 跡法進(jìn)行p21蛋白分析(B)。使用全長(zhǎng)p21cDNA作為Northern雜交分析的探針。C和D.不同p53 狀態(tài)的拉帕酚F處理和未處理的細(xì)胞中p21啟動(dòng)子熒光素酶活性。RK0細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞表達(dá) 野生型-P53蛋白而MDA-MB-231表達(dá)突變型-p53 AeLa細(xì)胞具有人乳頭狀瘤病毒;且p53蛋白 在這些細(xì)胞中是非功能性的。轉(zhuǎn)染了P21啟動(dòng)子熒光素酶構(gòu)建體的細(xì)胞未經(jīng)處理(DMS0)或 用拉帕酚F(50yM)處理24小時(shí)，然后分析熒光素酶活性。
[0011] 圖7:拉帕酚F通過減少其半衰期抑制突變型-p53的表達(dá)。A-C.拉帕酚F對(duì)表達(dá)野生 型P53的細(xì)胞(MCF-7和RK0)中的野生型p53蛋白表達(dá)具有最小的影響；然而拉帕酚F大大減 少了突變型_p53蛋白在MDA-MB-231、MDA-MB-468和T47D細(xì)胞中的表達(dá)(B和ChD和E.拉帕酚 F的處理降低了 MDA-MB-231細(xì)胞中突變型-p53蛋白的半衰期。首先用拉帕酚F(50yM)或未用 拉帕酚F對(duì)細(xì)胞處理24小時(shí)，然后向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入放線菌酮(50μg/ml)培養(yǎng)0-8小時(shí)并 在加入放線菌酮后〇、2、4、6和8小時(shí)收集細(xì)胞。對(duì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印記分析并確定用拉帕酚 F處理或未用拉帕酚F處理的細(xì)胞的突變型-p53的半衰期。F和G.拉帕酚F降低了 T47D細(xì)胞中 突變型-P53蛋白的半衰期。按所述確定突變型-p53的半衰期。
[0012] 圖8:拉帕酚F下調(diào)通常在人類癌癥中過度表達(dá)并與致癌性轉(zhuǎn)化有關(guān)聯(lián)的多種致癌 蛋白的表達(dá)。A-C.拉帕酚F抑制c-Myc(A)、MDM2(B)和HuR(C)的表達(dá)。未對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理 (Τ'）或用拉帕酚F(50yM)處理指定時(shí)間并使用指定的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
[0013] 圖9:拉帕酚F對(duì)作為異種移植物的Hela腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。用溶劑或拉帕 酚F(5毫克/千克/天或10毫克/千克/天）（靜脈注射)對(duì)荷瘤小鼠處理15天。如在方法和材料 中所述的對(duì)腫瘤尺寸、腫瘤體積和動(dòng)物體重進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果表示為平均值±SEM。相比于拉 帕酚F組，*?〈0.05。8中所列照片顯示取自未經(jīng)處理(溶劑小=7)或用拉帕酚？(511^/1^小= 7;和10mg/kg，N=6)處理的小鼠的實(shí)際腫瘤。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 我們已經(jīng)確定了拉帕酚F的抗腫瘤(抗癌)細(xì)胞增殖作用并證明了其在腫瘤細(xì)胞株 中的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性和在動(dòng)物模型中的腫瘤抑制活性。我們的結(jié)果表明拉帕酚F對(duì)代表 包括結(jié)腸、乳腺、肺、宮頸、前列腺、白血病、黑色素瘤和肉瘤細(xì)胞的不同組織的多種腫瘤細(xì) 胞株發(fā)揮強(qiáng)烈的生長(zhǎng)抑制作用。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的組合物和方法。所述組 合物包括拉帕酸F。所述方法包括向個(gè)體給藥治療有效量的包括拉帕酸F的組合物。已知拉 帕酚F的結(jié)構(gòu)。在圖1A中還提供了拉帕酚F的結(jié)構(gòu)。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于抑制實(shí)體腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述 方法包括向個(gè)體給藥治療有效量的包括拉帕酚F的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提 供了一種用于抑制包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的血液腫瘤(血癌）細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述 方法包括向個(gè)體給藥治療有效量的包括拉帕酸F的組合物。
[0017] 不希望受任何特定理論的束縛，我們的研究表明拉帕酚F主要通過誘導(dǎo)GjPG2細(xì)胞 周期阻滯介導(dǎo)其生長(zhǎng)抑制作用。除了其對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的作用，拉帕酚F還觸發(fā)一些腫瘤細(xì) 胞株中細(xì)胞死亡。不同細(xì)胞株響應(yīng)于拉帕酚F處理的細(xì)胞周期譜圖并不相同，比如，MCF-7細(xì) 胞主要在6 1被阻滯而RK0和MDA-MB-231細(xì)胞主要在G2被阻滯。拉帕酚F調(diào)控一些關(guān)鍵的細(xì)胞 周期調(diào)節(jié)因子(p21、p27、細(xì)胞周期蛋白B和CDK1和CDK2)的表達(dá)（圖3)。拉帕酚F誘導(dǎo)的p21和 P27的誘導(dǎo)以及⑶K1的抑制可足以阻止從GjljS的細(xì)胞周期進(jìn)程。同樣地，⑶K1和細(xì)胞周期 蛋白B的強(qiáng)烈抑制可足以將細(xì)胞阻滯在G 2。我們的研究進(jìn)一步確定p21對(duì)拉帕酚F介導(dǎo)的細(xì) 胞周期蛋白B和CDK1的下調(diào)和G2-阻滯是至關(guān)重要的。在p21-缺失的細(xì)胞中拉帕酚F介導(dǎo)的 細(xì)胞周期蛋白B和CDK1的減少消失（圖5 )，而且進(jìn)一步地，在缺乏p21的情況下，拉帕酚F介導(dǎo) 的〇2細(xì)胞周期阻滯也被顯著改變（圖5)。因此，我們的結(jié)果表明p21誘導(dǎo)在拉帕酚F介導(dǎo)的細(xì) 胞反應(yīng)中是重要的事件且在拉帕酚F介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白B/CDK1抑制和6 2細(xì)胞周期阻滯中 起關(guān)鍵作用。
[0018] 我們的研究還表明拉帕酚F誘導(dǎo)p21mRNA表達(dá)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，p21mRNA表達(dá)的強(qiáng)烈誘 導(dǎo)可以表明在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生響應(yīng)拉帕酚F的p21的激活。由于增加的p21啟動(dòng)子活性，可出現(xiàn) 由拉帕酚F增強(qiáng)的p21mRNA表達(dá)（圖6)。值得注意的是，在表達(dá)野生型p53(RK0和MCF-7)的細(xì) 胞中以及在具有突變型和非功能性p53(MDA-MB-231和HeLa)的細(xì)胞中發(fā)生拉帕酚F處理后 的P21啟動(dòng)子激活。此外，在缺乏p53基因（ρ537?的細(xì)胞中可以誘導(dǎo)P21。這表明拉帕酚F觸 發(fā)的P21的誘導(dǎo)以p53依賴性的方式發(fā)生。
[0019] 表型，拉帕酚F還誘導(dǎo)表達(dá)野生型-p53(MCF-7和RK0)或突變型/非功能性p53(MDA-MB-231和HeLa)的細(xì)胞中的生長(zhǎng)抑制。拉帕酚F還降低突變型-p53表達(dá)并減少突變型-p53蛋 白半衰期（圖7)。我們的發(fā)現(xiàn)表明拉帕酚F抑制突變型-p53表達(dá)并對(duì)拉帕酚F在靶向具有突 變型-P53的腫瘤細(xì)胞中的用途提供支持。
[0020] 我們的結(jié)果還表明拉帕酚F顯著抑制大量致癌蛋白的表達(dá);這些致癌蛋白包含C-Myc，MDM2和HuR蛋白（圖8)。所有這些表明蛋白（c