劑處理的細(xì)胞中的細(xì)胞核更大;在 拉帕酚F處理的細(xì)胞中還注意到凋亡片段細(xì)胞核（圖2B，右側(cè)，箭頭）。這些結(jié)果表明拉帕酚F 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在且它還觸發(fā)腫瘤細(xì)胞亞群中的細(xì)胞死亡。
[0058] 拉帕酚F通過調(diào)控關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控因子影響周期進(jìn)程。我們研究了拉帕酚F誘 導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的分子機(jī)制。圖3A-D顯示細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制因子p21和 P27在拉帕酚F處理的細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，而CDK2、細(xì)胞周期蛋白B和CDK1在不同的 細(xì)胞株中的水平明顯降低。確定的是CDK2活性對于G1/S轉(zhuǎn)換是至關(guān)重要的；而p21和p27誘 導(dǎo)阻止G1/S轉(zhuǎn)換；另一方面，G^M轉(zhuǎn)換需要細(xì)胞周期蛋白B/CDK1活性且有絲分裂的早期需 要細(xì)胞周期蛋白B/CDK1。
[0059]拉帕酚F對凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。上述結(jié)果表明拉帕酚F不僅誘導(dǎo)GjPGdH胞周期 阻滯還觸發(fā)腫瘤細(xì)胞群體的亞群中的細(xì)胞死亡。接下來，我們試圖檢測拉帕酚F對凋亡信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。我們發(fā)現(xiàn)拉帕酚F引起HeLa細(xì)胞中半胱天冬酶9和3激活（圖4)。然而，在MCF-7 細(xì)胞中對于半胱天冬酶8和9沒有發(fā)現(xiàn)半胱天冬酶激活的明顯證據(jù)。由于外顯子3中的基因 敲除，在MCF-7細(xì)胞中沒有檢測到半胱天冬酶3。在拉帕酚F處理的MDA-MB-231細(xì)胞中觀察到 半胱天冬酶8、9和3的激活（圖4)。因此，這些結(jié)果提供表明拉帕酚F激活一些細(xì)胞類型中的 凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生化證據(jù)。
[0060] P21對拉帕酚F介導(dǎo)的G2-阻滯和細(xì)胞周期蛋白B/⑶K1下調(diào)是至關(guān)重要的。已經(jīng)確 定的是作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的P21在調(diào)控G1向S的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作 用。然而，很少研究口21在62-1轉(zhuǎn)換中的作用。我們的上述結(jié)果表明p21誘導(dǎo)與細(xì)胞周期蛋白 B和⑶K1的下降以及拉帕酚F處理的RK0和MDA-MB-231細(xì)胞中的G2阻滯同時發(fā)生（圖3)。先前 的研究已經(jīng)顯示由組蛋白脫乙酰酶抑制因子丁酸鹽介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白B的下調(diào)需要p21 誘導(dǎo);且T-鈣粘蛋白介導(dǎo)的62阻滯也需要p21。因此我們試圖確定p21誘導(dǎo)是否對拉帕酚F介 導(dǎo)的CDK1/細(xì)胞周期蛋白B抑制和6 2細(xì)胞周期阻滯發(fā)揮作用。在本文中，我們首先使用p21- 敲除的細(xì)胞研究缺失P21是否影響細(xì)胞周期蛋白B和CDK1在拉帕酚F處理的細(xì)胞中的表達(dá)水 平。圖5A顯示由拉帕酚F引起的細(xì)胞周期蛋白B和CDK1的下降在p21-缺陷(ρ2ΓΛ)細(xì)胞(泳道 4)中被明顯消失。我們還使用慢病毒介導(dǎo)的RNAi敲除方法研究p21敲除對細(xì)胞周期蛋白Β和 CDK1調(diào)控的作用。如圖5B所示，在拉帕酚F處理后的任意序列RNAi細(xì)胞(泳道2)中觀察到的 細(xì)胞周期蛋白B和CDK1的下降在p21敲除的細(xì)胞(泳道4和6)中被削弱。我們進(jìn)一步研究了 P21敲除是否對拉帕酚F介導(dǎo)的G2阻滯有影響。如圖5C和5D所示，通過靶向p21轉(zhuǎn)錄的不同區(qū) 域的兩種不同的shRNA進(jìn)行的p21敲除顯著降低了阻滯于6 2期的細(xì)胞的群體。這些結(jié)果表明 P21對于拉帕酚F介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白B和CDK1的抑制以及G2阻滯是至關(guān)重要的。
[0061]拉帕酚F在轉(zhuǎn)錄水平以不依賴于P53的方式使P21上調(diào)。我們接下來研究拉帕酚F在 轉(zhuǎn)錄水平或后轉(zhuǎn)錄水平是否使P21上調(diào)發(fā)生。圖6顯示p21mRNA(6A)和蛋白（6B)的水平在拉 帕酚F處理的細(xì)胞中均有所提高。這些結(jié)果表明在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生拉帕酚F介導(dǎo)的p21上調(diào)，盡 管不能排除在后轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生其他調(diào)控。然后我們確定拉帕酚F使p21mRNA水平升高是否歸 因于對p21啟動子的誘導(dǎo)活性。用拉帕酚F處理或未用拉帕酚F處理后對引入了 p21啟動子熒 光素酶構(gòu)建體的細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性的檢測。如在圖6C中所看到的，在用拉帕酚F處理 后，P21啟動子活性在四種不同的細(xì)胞株(狀0、1?^-7、他1 &、1?^-1?-231)中被顯著增強(qiáng)。值 得注意的是，RK0和MCF-7細(xì)胞表達(dá)野生型p53、MDA-MB-231細(xì)胞在280密碼子(精氨酸至賴氨 酸)處具有P53突變，HeLa細(xì)胞擁有使p53失活的人類乳頭瘤病毒。為了進(jìn)一步確定拉帕酚F 介導(dǎo)的P21上調(diào)是否是p53依賴性的，使用RKO p53-精通(ρ53+Λ)和p53-缺陷(p53+)細(xì)胞研 究口21的啟動子活性。如圖60所示，拉帕酚?導(dǎo)致?53 +/+細(xì)胞中？21啟動子的3.5倍誘導(dǎo)。有趣 的是，盡管相比于未處理的P53-精通(ρ53+Λ)細(xì)胞中p21的基礎(chǔ)水平，未經(jīng)處理的p53-缺陷 (P53+)細(xì)胞中的p21的基礎(chǔ)水平顯著較低，拉帕酚F能夠使p53+細(xì)胞中p21啟動子活性上 調(diào)8.3倍（圖6D)。雖然p53可能有助于p53精通細(xì)胞中的p21調(diào)控是仍有可能的，但是我們的 數(shù)據(jù)表明拉帕酚F介導(dǎo)的p21轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)可能以不依賴于p53的方式發(fā)生。
[0062] 拉帕酚F通過降低突變型-p53的半衰期抑制突變型-p53。已經(jīng)確定的是突變型-P53不僅失去了作為腫瘤抑制因子的功能，而且獲得了有助于致癌性轉(zhuǎn)化的致癌潛力。接下 來，我們試圖確定拉帕酚F對突變型-p53是否具有調(diào)控作用。如圖7所示，拉帕酚F似乎對 MCF-7細(xì)胞中野生型-p53的水平?jīng)]有顯著影響（圖7A)但顯著降低了 MDA-MB-231細(xì)胞中突變 型-P53的水平(B)。為了進(jìn)一步檢測拉帕酚F對p53表達(dá)的作用，我們檢測了三種其它表達(dá)野 生型-p53(RK0)或突變型-p53(MDA-MB-468，T47D)的腫瘤細(xì)胞株。如圖7C所示，拉帕酚F并沒 有顯著影響RK0細(xì)胞中野生型-p53的表達(dá)水平，而MDA-MB-468和T47D細(xì)胞中拉帕酚F處理強(qiáng) 烈抑制了突變型-P53。我們還檢測了拉帕酚F下調(diào)突變型-p53水平的可能機(jī)制并為此研究 了拉帕酚F對突變型p53蛋白的穩(wěn)定性的作用。如圖7D-7F所示，拉帕酚F處理導(dǎo)致突變型-p53蛋白半衰期的下降，突變型-p53蛋白半衰期從未經(jīng)處理的細(xì)胞中的>8小時降低至處理 過的MDA-MB-231細(xì)胞中的~3小時（圖7D和7E)。且在用拉帕酚F處理的T47D細(xì)胞(表達(dá)突變 型p53)中也觀察到相同的結(jié)果（圖7F和7G)。這些結(jié)果表明拉帕酚F處理至少部分通過降低 突變型-P53蛋白的半衰期下調(diào)了突變型-p53的水平。這些結(jié)果還表明拉帕酚F部分通過其 對降低突變型-P53水平的作用似乎導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長抑制。
[0063]拉帕酚F顯著下調(diào)包括c_My、MDM2和HuR的多種其他致癌蛋白的表達(dá)。我們檢測了 拉帕酚F對c-My、MDM2和HuR的蛋白表達(dá)的作用。這些蛋白通常在人類癌癥中過度表達(dá)且在 致癌過程中發(fā)揮重要作用;且它們還對保持癌細(xì)胞的致癌表型很重要。c_Myc和MDM2是抗癌 藥物開發(fā)的重要靶標(biāo)。HuR也已被證明是癌癥發(fā)展的決定因素且在多種人類癌癥類型中的 腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用。呈現(xiàn)于圖8中的我們的結(jié)果表明拉帕酚F強(qiáng)烈下調(diào)這些癌基因蛋 白。我們的結(jié)果表明通過抑制包括上述突變型-p53、c-Myc、MDM2和HuR的多種致癌蛋白以及 細(xì)胞周期進(jìn)程啟動子（如CDK1、CDK2、細(xì)胞周期蛋白B)，拉帕酚F可以有效地抑制癌細(xì)胞生 長。拉帕酚F抑制多種致癌靶標(biāo)的能力令人意想不到且是這種新型抗癌藥物的重要優(yōu)勢。
[0064] 拉帕酚F抑制動物體內(nèi)的腫瘤生長。使用HeLa細(xì)胞作為裸鼠內(nèi)的異種移植物，我們 還研究了拉帕酚F對體內(nèi)腫瘤生長的作用。腫瘤細(xì)胞接種九天后，每天用溶劑或拉帕酚F (5mg/kg或10mg/kg)對小鼠進(jìn)行一次靜脈注射并持續(xù)15天。我們的結(jié)果（圖9)揭示在接受拉 帕酚F處理的小鼠體內(nèi)顯著抑制腫瘤生長。如圖9A所示，藥物處理15天后，相對于溶劑處理 群組，拉帕酚F抑制54%(5毫克/千克/天，？〈0.001小=7)和64%(10毫克/千克/天，？〈 0.001，N=6)的腫瘤生長。圖9還顯示拉帕酚F劑量從5毫克/千克/天增加至10毫克/千克/天 進(jìn)一步降低了腫瘤體積和重量。重要的是，我們沒有觀察到給予15天的拉帕酚F(5毫克/千 克/天和10毫克/千克/天)處理的小鼠致死或體重減輕（圖9D)。這些結(jié)果表明給以小鼠的拉 帕酚F耐受性良好且抑制體內(nèi)腫瘤生長。因此我們的結(jié)果首次表明拉帕酚F能夠有效地抑制 移植在動物上的人類腫瘤(HeLa腫瘤)并因此提供表明拉帕酚F具有開發(fā)為用于治療人類癌 癥的抗癌藥物的很大潛力的重要信息。
[0065] 盡管通過具體的實施方式描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以對本發(fā) 明進(jìn)行常規(guī)修改且這樣的修改意在成為本公開的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種減少癌細(xì)胞生長的方法，包括向需要治療的個體給藥有效量的藥學(xué)上可接受的 載體中的拉帕酚F。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述拉帕酚F通過避免首過代謝的途徑給藥。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述途徑包括靜脈內(nèi)、腸胃外、腫瘤內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、 盧頁內(nèi)和皮下。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述給藥在化療、手術(shù)治療或放射治療之前進(jìn)行， 與化療、手術(shù)治療或放射治療同時進(jìn)行，或繼化療、手術(shù)治療或放射治療之后進(jìn)行。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個體對用化療藥物進(jìn)行的治療沒有響應(yīng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌細(xì)胞表現(xiàn)為突變型-p53或野生型p53。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌細(xì)胞在腫瘤內(nèi)。
【專利摘要】提供了一種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包括向需要治療的個體給藥包括治療有效量的拉帕酚F的組合物。還提供了包括拉帕酚F和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
【IPC分類】A61K31/015
【公開號】CN105592845
【申請?zhí)枴緾N201480038463
【發(fā)明人】黃英, 胡英杰, 孫清, 劉抗倫, 沈小玲, 賽義德·M.·舍克
【申請人】紐約州立大學(xué)研究基金會, 廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2014年5月6日
【公告號】EP2994118A1, WO2014182653A1, WO2014182653A8