y)的焚光素酶檢測系統(tǒng)（Thermo Scientific，Rockford， IL)對每個(gè)細(xì)胞裂解物的螢光素酶活性進(jìn)行分析。
[0042]細(xì)胞周期分析和有絲分裂指數(shù)
[0043]按如下通過流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞周期譜圖。為了確定有絲分裂指數(shù)，用或未用拉 帕酚F處理的細(xì)胞以4 '，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)有絲分裂 細(xì)胞的數(shù)量。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)超過600個(gè)細(xì)胞且實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次。
[0044] 蛋白質(zhì)印跡分析和Northern印跡分析
[0045] 通過標(biāo)準(zhǔn)方案完成蛋白質(zhì)印跡分析。抗體來源如下:p21和GAFOH的抗體來自Santa Cruz Biotechnology公司（Santa Cruz，CA);細(xì)胞周期蛋白B1 抗體來自BD bioscience公司 (San Jose，CA);p27抗體來自Cell Signaling Technology公司（Danvers，MA);CDKl和CDK2 來自 Assay Biotechnology公司（Sunnyvale，CA)。進(jìn)行Northern印跡分析且用全長p21cDNA 作為探針來探測p21cDNA的表達(dá)。
[0046] 體內(nèi)研究
[0047] 所有動物研究得到批準(zhǔn)并根據(jù)廣州中醫(yī)藥大學(xué)的動物倫理委員會的動物保健和 使用指南（文件號syxk(粵）2008-0001)執(zhí)行。首先在背部用5X10 6個(gè)HeLa細(xì)胞對BALB/c裸 鼠（雌性，4-5周齡）進(jìn)行皮下注射以建立腫瘤異種移植。腫瘤注射后9天，將具有90mm 3-290mm3的腫瘤體積的小鼠隨機(jī)分為3組;小鼠的每個(gè)治療組中的平均起始腫瘤體積分別為 161 · 28±23 · 9mm3(溶劑對照）、160 · 7± 17 · 7mm3(用5mg/kg的拉帕酚F處理的小鼠）和144 · 5土 20.5!111113(用1〇1^/1^的拉帕酚？處理的小鼠）。然后通過靜脈注射用拉帕酚？(5毫克/千克/ 天，N = 7,或10毫克/千克/天，N = 6)或用等體積的溶劑(含有5%的DMS0和5%的吐溫80的 5%的葡萄糖溶液，5毫克/千克/天，N=7)處理15天。每4天通過用卡尺測量兩個(gè)垂直直徑來 監(jiān)測腫瘤的大小。以體積=長X寬 2X〇. 5計(jì)算腫瘤體積。每天對小鼠的死亡和體重情況進(jìn) 行監(jiān)測。在第15天通過按照指南處死小鼠終止動物實(shí)驗(yàn)（腫瘤大小超過對照動物的20mm的 平均直徑）。然后對腫瘤異種移植進(jìn)行剝離并稱重。所有的結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)平均 誤差(SEM)。采用單因素方差分析對各種治療方法的效果進(jìn)行分析且認(rèn)為P值<0.05具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[0048] 結(jié)果
[0049] 從牛蒡中分離的拉帕酚F的提取和結(jié)構(gòu)表征。在室溫下用甲醇(Me0H，80%)提取風(fēng) 干粉末狀的牛蒡的種子。通過在真空中除去甲醇得到甲醇提取物。漿狀甲醇提取物進(jìn)一步 通過石油醚、氯仿（CHC1 3)和乙酸乙酯分別進(jìn)行萃取。然后將氯仿提取物（100g)在硅膠和 0DS柱上用CHCl3/Me0H(99:l至90:10)和]\^0!1/!120(30:70至60:40)洗脫來反復(fù)進(jìn)行柱色譜 ； 在這些提取和純化步驟之后，與12種其它化合物一起得到無色無定形粉末命名為AL12的化 合物。對于結(jié)構(gòu)鑒定，測量所有分離的化合物的光譜數(shù)據(jù)；在TU-1901紫外分光光度計(jì) (Purkinje General，中國）上進(jìn)行紫外吸收光譜；在API 2000 LC/MS/MS裝置或MAT95XP質(zhì) 譜儀上測量電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS);在Bruker DRX-400儀器上用甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)記 錄1Η和 13C核磁共振(NMR)?；诎‥SI-MS m/z 749( [M+C1 ] -)、UV(MeOHH馱(l〇ge): 232 (4.28)，282(4.00)腦的光譜數(shù)據(jù)信息41^12的化學(xué)結(jié)構(gòu)被鑒定為拉帕酚？，且1!1-匪1?和 13(：-NMR(補(bǔ)充信息）的數(shù)據(jù)遵守已報(bào)道的那些。本研究中使用的拉帕酚F的純度通過HPLC測定為 99.19%。拉帕酚F的化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1A。
[0050] 如下為拉帕酸F的1H NMR光譜(400MHz，CDC13):
[0051] iH-NMI^CDCh，400ΜΗζ)δ(ρρπ〇 :6.61(lH，s，H-2) ,6.48(lH，s，H-6) ,2.98(lH，dd，J = 14.O,4.8Hz，H-70)，2.84(lH，dd，J = 14.O,7.2Hz，H-7a)，2.59(lH，m，H-8)，6.43(lH，s，H-2'），6.53(lH，s，H-6'），2.57(lH，dd，J=13·6,7·2Ηζ，Η-7'β)，2.50(lH，dd，J=14.4,7.2Hz， H-7'a)，2.49(lH，m，H-8'），4.2O(lH，dd，J = 9.2,6.8Hz，H-9'0)，3.89(lH，dd，J=11.2， 5.6Hz，H-9'a)，6.92(lH，s，H-2"），6.82(lH，d，J = 8.0Hz，H-5"），6.86(lH，d，J = 2Hz，H-6"）， 5.44(lH，d，J = 7.6Hz，H-7"），3.54(lH，dd，J = 12.8,5.6Hz，H-8"），3.88(lH，m，H-9"0) ,3.87 (lH，m，H-9"a)，6.92(lH，s，H-2" '），6.84(lH，m，H-5"'），6.86(lH，d，J = 2.0Hz，H-6" '），5.45 (lH，d，J = 7.6Hz，H-7" '），3.54(lH，dd，J= 12.80，5.6Hz，H-8" '），3.88(lH，m，H-9" 'β) ,3.87 (lH，m，H-9" 'α)，3·78,3·82(3Η各，s，2X0Me)，3.81(6H，s，2X0Me)。
[0052] 如下為拉帕酸F的13C NMR光譜（100MHz，CDC13):
[0053] 13C-NMR(CDC13，ΙΟΟΜΗζ)δ(ρρπι):128.4(C，C-1),112.8(CH，C-2)，147.2(C，C-3)， 145.6(C,C-4),132.6
[0054] (C,C-5),114.3(CH,C-6),34.8(CH2,C-7),46.6(CH,C-8),178.7(C,C-9),128.9 (C，C-1'），113.2(CH，C-2'），147.1(C，C-3'），145.6(C，C-4'），132.8(C，C-5'），114.3(CH，C-6'），38.4(CH2，C-7'），41.3(CH，C-8'），71.3(CH2，C-9'），131.0(C，C-l"），108.8(CH，C-2"）， 146·7(C，C-3"），144.3(C，C-4"），116.6(CH，C-5"），119.4(CH，C-6"），88.0(CH，C-7"），53.5 (CH，C-8"），64.0(CH2，C-9"），131.4(C，C-1" '），108.8(CH，C-2" '），145.7(C，C-3" '），144.2 (C，C-4"'），117.3(CH，C-5"'），119.3(CH，C-6"'），88.0(CH，C-7"'），53.4(CH，C-8"'），64.0 (CH 2，C-9" '），56 · 0 (CH3，C-3 ' -和C-3" OMe)，56 · 1 (CH3，C-3" -和C-3" ' -〇Me)。
[0055] 拉帕酸F在多種腫瘤細(xì)胞株中呈現(xiàn)出生長抑制。
[0056] 通過最初的細(xì)胞毒性篩選實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)拉帕酚F對不同組織類型（如結(jié)腸(HT29、 狀0、》：1!16)、乳腺（]\?^-7、]\〇^-]\?-231、]\?^-]\?-468、8丁549、!185781')、肺（厶549)、宮頸 (Hela)和其他組織類型）的腫瘤細(xì)胞株呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的生長抑制作用（圖1B和1C)。我們還發(fā) 現(xiàn)其他腫瘤類型(諸如前列腺癌(DU145)、白血病(K562、HL60和Jurkat)、肉瘤(U20S)和黑色 素瘤(A375、M 〇l 103))在用拉帕酚F處理后也呈現(xiàn)出生長抑制（圖1H和1N)。拉帕酚F介導(dǎo)的 細(xì)胞生長抑制為時(shí)間依賴性和劑量依賴性的（圖ID和1E)且MCF-7、MDA-MB-231和RKO細(xì)胞的 預(yù)計(jì)絕對EC5Q分別為13.3、16.8和25.2μΜ。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)在相同的條件下處理(3 天）（圖1F)或?qū)⒀娱L處理至六天（圖1G)時(shí)拉帕酚F對MCF10A非癌性乳腺上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出最 小的細(xì)胞毒性。
[0057] 拉帕酚F誘導(dǎo)GjPG2的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞死亡。我們試圖確定拉帕酚F介導(dǎo)的細(xì) 胞生長抑制的作用機(jī)制。圖2A顯示拉帕酚F處理的和未處理的細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明拉帕酚F顯著增加了2N &-期的群體或4N G2-(或M)-期的群體(圖 2A)。似乎在拉帕酚F引起的響應(yīng)中存在一些變化。例如，MCF-7和HeLa細(xì)胞主要被阻滯在2N Gi-期而MDA-MB-231和RK0細(xì)胞主要被阻滯在4N G2-(或M)-期（圖2A)。拉帕酚F不僅在一些細(xì) 胞株(如HeLa、MDA-MB-231和RK0)中誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯，拉帕酚F還在細(xì)胞群體的亞群中誘導(dǎo)細(xì) 胞死亡。圖24顯示在拉帕酚?處理的他1^細(xì)胞中還觀察到亞-2姑田胞死亡群體(81113-61)的顯 著增加（從1 %至15 % )。我們還注意到當(dāng)拉帕酚F處理時(shí)間延長至96小時(shí)時(shí)，細(xì)胞死亡群體 進(jìn)一步增加(數(shù)據(jù)未顯示）。為了鑒定在拉帕酚F處理后4N-群體是否被阻滯在G 2期或有絲分 裂期，確定了有絲分裂指數(shù)(MI)。圖2B顯示在用溶劑(DMS0)處理的細(xì)胞中，有絲分裂細(xì)胞核 為約3-5% (左側(cè)，箭頭）。另一方面，在拉帕酚F處理的細(xì)胞群體中，沒有觀察到有絲分裂細(xì) 胞核（圖2B，右側(cè)）。這些結(jié)果是可再現(xiàn)的且表明4N-細(xì)胞群體代表G 2期而不是有絲分裂階 段。進(jìn)一步地，拉帕酚F處理的細(xì)胞中的細(xì)胞核相比于溶