添加特定體積的處于特定濃度的中和緩沖 劑，可以將最終pH設(shè)計為在生理pH附近，這仍在EPPS緩沖劑的可用緩沖范圍內(nèi)。
[0104] 也可以將中和緩沖劑在其可用緩沖范圍之外使用。例如，Hepes緩沖劑(pKa 7.5) 可以在約pH 9使用，前提是要非常小心地避免在緩沖能力極低的區(qū)域中調(diào)節(jié)pH時的過調(diào)節(jié) (overshoot)風(fēng)險。因此，將緩沖劑拉出其正常緩沖范圍（即，pKa±l單位）的過量堿(例如， NaOH)中和了洗脫的抗體中的部分酸而形成鹽，由此使實際的中和性緩沖物質(zhì)（即，在該情 形中為Hepes)的質(zhì)量和最終濃度最小化。
[0105] 大多數(shù)抗體綴合反應(yīng)在pH 5至pH 9進(jìn)行，因為大多數(shù)普通反應(yīng)涉及NHS酯(通常在 約pH 8反應(yīng)）、馬來酰亞胺(約6.5-7.5)、碳二亞胺(通常約pH 5-6)和硫醇化試劑(通常約pH 8- 8.5)〇
[0106] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，中和緩沖劑包括兩種緩沖性物質(zhì)，一種（"高pKa組 分"）的pKa高于8,例如優(yōu)選約pKa 9或pKa 10,而另一種（"鎖定緩沖齊『）的pKa為約7。
[0107] 中和緩沖劑的兩種組分可以分別添加或作為混合物添加。
[0108] 當(dāng)這兩種組分分別添加時，優(yōu)選將鎖定緩沖劑在高pKa組分之前添加，以避免在添 加高pKa組分時過調(diào)節(jié)至高pH值。
[0109] 在采用新型CFEB的探索性研究中，分開添加是有優(yōu)點的，因為可以逐份地添加高 pKa組分并在每次添加后測定pH。隨后，可以單次添加組合的高pKa組分/鎖定緩沖溶液，從 而通過以所需的量預(yù)混這兩種物質(zhì)來實現(xiàn)的相同的終點。
[0110] 作為選擇，可以將已知體積的幾種潛在CFEB(或者處于不同pH值的一種CFEB)與一 系列潛在中和緩沖劑中的每一種（以不同的體積)混合，且可在每種情形中確定最終pH并制 表。在后續(xù)實驗中，根據(jù)抗體在CFEB中的溶液的測定體積，可以參考表來確定使用何種中和 緩沖劑和添加多少來得到所需的最終pH。
[0111]添加兩種緩沖劑組分導(dǎo)致洗脫的抗體的中和，其后創(chuàng)建包含CFEB、高pKa組分和鎖 定緩沖劑(忽略抗體和任何其它的以極低濃度存在的緩沖物質(zhì)）的三重緩沖體系。
[0112]高pKa組分傾向于來自通常具有相對較高的pKa值的N-環(huán)己基系列緩沖劑，但這并 非意在進(jìn)行限制。
[0113]中和緩沖劑的pH優(yōu)選高于pH 7,更優(yōu)選高于8,進(jìn)而更優(yōu)選為pH 8.5至pH 11。約pH 9- 9.5的pH特別有用，該pH不太可能在接觸CFEB混合物時損害抗體。對于對高pH敏感的抗 體，當(dāng)然可以使用更低的pH。
[0114] 如果使用高pKa組分，理想的是中和性溶液的pH在pKa值的一個單位上下。如果pH 高于pKa值，將比pH低于pKa時需要更少量的緩沖物質(zhì)來中和CFEB。然而，由于高pKa組分在 近中性pH幾乎沒有緩沖能力，用于中和CFEB的量并非特別重要，且必要時使pH遠(yuǎn)離pH 7將 不會受到高pKa組分的阻礙。
[0115] 當(dāng)中和性緩沖劑被添加至經(jīng)CFEB洗脫的抗體(通常處于pH 2.3-3.0附近)時，混合 物將變得更為中性。在審慎選擇抗體(處于CFEB中）和中和性緩沖液的體積后，鎖定緩沖劑 將能使pH保持（即，"鎖定"）在pH 6至8(即，鎖定緩沖劑pKa±lpH單位）。
[0116] 鎖定緩沖劑理想地以盡可能低的濃度存在，但其必須以足以容許CFEB溶液與中和 緩沖液的體積比的輕微變化(該變化可能由于例如移液或測量的不準(zhǔn)確性而發(fā)生）的量存 在，以確保pH處在儲存抗體所希望的范圍內(nèi)。期望的是最終濃度約為10mM，但這并不作為限 制。
[0117]如果鎖定緩沖劑在高pKa組分之前添加，則后者必須快速添加，因為鎖定緩沖劑通 常并非主要的中和性物質(zhì)。
[0118] 在抗體樣品被中和后，源自中和性溶液的高pKa組分不再是有效的緩沖劑。類似 地，pKa大體上約為(但優(yōu)選低于)柱洗脫pH( 即，在約pH 2.5的區(qū)域)的CFEB在pH 7時也不是 有效的緩沖劑。相反，以相對較低的濃度存在的"鎖定"緩沖劑(pKa約為7)提供了所有的有 效緩沖能力，但可以通過添加第四緩沖劑(或者酸或堿)來使溶液的pH相對容易地移動到pH 5至pH 9范圍內(nèi)的新pH值。即使在這個寬的取值范圍內(nèi)，高pKa緩沖組分(假定pKa>9,優(yōu)選為 9.5以上)和CFEB在抵抗任何所需的pH變化方面均不是特別有效。
[0119] 鎖定緩沖劑的結(jié)構(gòu)特征與對于中和緩沖劑所要求的結(jié)構(gòu)特征相似，區(qū)別在于理想 的是鎖定緩沖劑的pKa值應(yīng)當(dāng)為約pH 7。優(yōu)選地，該pKa應(yīng)為pH 6至8,且最終pH約為7~7.5， 但也可以在該范圍之外工作，前提是抗體在所選的最終pH值處穩(wěn)定。
[0120] 優(yōu)選的鎖定緩沖劑包括M0PS(pKa7.2)和HEPES(pKa7.5)，但這并非限制性。具有 類似pKa值的其它緩沖劑也可以用作鎖定緩沖劑。
[0121] 高pKa組分和鎖定緩沖劑的優(yōu)選組合(不論分開添加還是一起添加)包括CHES以及 MOPS或HEPES。同樣，這些組合并非限制性。
[0122] 最后，可以在適當(dāng)?shù)膒H值使用某些含氨基的羧基緩沖劑，其作為CFEB或作為中和 緩沖劑(例如，三(羥甲基）甲基甘氨酸和相關(guān)分子N，N-二羥乙基甘氨酸）。
[0123] 從緩沖劑理論出發(fā)，顯而易見的是，通過將不同的CFEB與包含高pKa組分和鎖定緩 沖劑的中和性溶液組合，可以創(chuàng)建約pH 7的各種各樣的多組分低緩沖能力溶液。除了顯然 不能有具有會干擾預(yù)期綴合反應(yīng)的官能團(tuán)的組分外，中和緩沖劑中的具體組分不受限制。
[0124] 使用本發(fā)明的方法的綴合反應(yīng)包括:使處于合適pH的抗體/CFEB混合物與包含活 化的標(biāo)記物(或標(biāo)記物和活化性化學(xué)物質(zhì)）、緩沖劑和必要的其它添加劑的組分混合物相接 觸。在某些情形中，連接的是帶有有用的官能團(tuán)的小分子而非標(biāo)記物，通常是為了允許稍后 通過該官能團(tuán)來連接標(biāo)記物。確切的添加順序可以根據(jù)綴合反應(yīng)的性質(zhì)而有所不同，但最 終在綴合反應(yīng)開始時使得CFEB、鎖定緩沖劑和/或中和緩沖劑、標(biāo)記物(或衍生化試劑)和抗 體(或待標(biāo)記的蛋白）同時彼此相接觸，這是本發(fā)明的方法的獨特之處。這一概念是在以下 的出人意料的發(fā)現(xiàn)之后建立的：在某些情形中，如甘氨酸等氨基酸在碳二亞胺介導(dǎo)的抗體 和納米顆粒之間的反應(yīng)中可以被容許。
[0125] 在任何標(biāo)記反應(yīng)中，重要的是，當(dāng)將中和的抗體的溶液添加至反應(yīng)時，其不會使混 合物的pH遠(yuǎn)離所需的綴合pH。當(dāng)抗體占總反應(yīng)體積的一小部分且抗體溶液的緩沖能力低 時，發(fā)生顯著pH變化的概率較低。因此，用CFEB和合適的中和緩沖劑配制并以合適的體積添 加的抗體將會與許多不同的受緩沖的綴合反應(yīng)相容。
[0126] 如果中和的抗體較稀且體積添加量將占總測試體積的較大比例，則必須將綴合反 應(yīng)中的主要緩沖性物質(zhì)充分濃縮，以便接納抗體樣品且不發(fā)生任何顯著的pH變化。作為另 一選擇，可以利用本領(lǐng)域熟知的簡單技術(shù)(例如，微濃縮)提高抗體濃度來減少所要添加的 體積。
[0127] 然而，如果目的是僅進(jìn)行一種類型的綴合反應(yīng)，可以將CFEB中的抗體中和并直接 調(diào)節(jié)至所需的綴合pH。在這種情況下，無需將pH調(diào)節(jié)至其它值的靈活性，但在避免綴合前的 透析步驟這一點上仍是巨大的益處。
[0128] 例如，如果綴合反應(yīng)將在pH 9進(jìn)行，則可以簡單地將抗體調(diào)節(jié)至pH 9。在這一情景 中，不必使用pKa約為7的鎖定緩沖劑;而是可以將略高于pH 9(且理想的是pKa約為9)的緩 沖劑與洗脫的抗體以所需的體積比混合以實現(xiàn)所需的最終pH。
[0129] 如果僅要將一部分抗體在pH 9綴合，則優(yōu)選僅將一部分抗體調(diào)節(jié)至pH 9,或者使 用合適的鎖定緩沖劑和高pKa的中和緩沖劑的組合將整個CFEB抗體溶液調(diào)節(jié)至約pH 7。然 后可以根據(jù)需要并在需要時將經(jīng)中和的溶液的一部分的pH提高至pH 9。
[0130] 當(dāng)處理大體積（即，數(shù)毫升甚至數(shù)升）的抗體時，對于用精確體積的中和緩沖劑來 中和CFEB中的洗脫抗體的需求不那么重要，因為此時能將pH探針插入抗體溶液中。理想地， 將具有適當(dāng)pKa的堿性緩沖劑(或處于合適的pH的鎖定緩沖劑和高pKa組分的組合)快速添 加至CFEB而無需考慮確切的最終pH，除了該pH必須被提高至足以使pH引起的抗體損害最小 化的程度，并且優(yōu)選地使pH停留在低于最終所需的pH的點。其后，如果在中和步驟中pH發(fā)生 過調(diào)節(jié)，可以利用pH計并添加合適的堿(例如，NaOH溶液或緩沖液)或酸(例如，稀HC1)來最 終調(diào)節(jié)至正確的pH。
[0131] 通過謹(jǐn)慎地選擇洗脫緩沖劑、其濃度、其可離子化基團(tuán)的pKa和洗脫緩沖液的pH (尤其是相對于其pKa值），可以用較高pH的緩沖劑或者緩沖劑組合(其具有謹(jǐn)慎選擇的pKa 值)來容易地中和抗體，而不以任何方式限制抗體在未來的不同類型的綴合反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0132] 還可以用高pH溶液(pH>10)而不是低pH溶液來洗脫抗原親和柱。相同的CFEB要求 也適用于此處;洗脫緩沖劑必須與期望的綴合反應(yīng)類型相容。采用從低pH至高pH轉(zhuǎn)變的洗 脫策略時，選擇出合適的中和（即，酸性)緩沖劑變得更具挑戰(zhàn)性，因為顯見的緩沖劑(甘氨 酸、檸檬酸)對于許多流行的綴合化學(xué)是不允許的。然而，如果計劃進(jìn)行非氨基依賴性反應(yīng)， 則或許可以使用檸檬酸作為中和緩沖劑。如果考慮碳二亞胺反應(yīng)，則中和緩沖劑可以是低 pH甘氨酸，其可與合適的鎖定緩沖劑一同使用，但優(yōu)選的是使用低pH甘氨酸甜菜堿和鎖定 緩沖劑。
[0133] N，N_二甲基甘氨酸(氨基pKa為9.8)是在高pH洗脫親和柱時的良好候選物。在此情 形中，中和緩沖劑可以具有約7的pKa并作為pH 6的溶液添加。緩沖劑必須經(jīng)充分濃縮以中 和高pH CFEB，或者可以添加酸（但大多數(shù)情況下不是檸檬酸、乙酸或低pH甘氨酸）來調(diào)節(jié) pH，并在可能時借助pH計進(jìn)行監(jiān)測。pKa約為7的緩沖劑則充當(dāng)鎖定緩沖劑，以避免過調(diào)節(jié)至 極低的pH值。合適濃度的鹽酸將是中和性酸的顯而易見的選擇，但并非限制性選擇。作為另 一選擇，可以使用低pH甘氨酸甜菜堿(優(yōu)選與上述pKa約為7的鎖定緩沖劑組合)來中和用于 洗脫親和柱的高pH溶液。
[0134] 利用本發(fā)明的方法，將具有謹(jǐn)慎選擇的濃度和pKa值的緩沖劑的混合物與洗脫的 抗體在CFEB緩沖劑中的制備物簡單組合，從而提供了用于抗體儲存的多組分中性溶液，其 pH隨后可以在pH 5至9范圍內(nèi)容易地改變以適于幾乎任何綴合反應(yīng)，即，涉及NHS酯反應(yīng)的 反應(yīng)、異硫氰酸酯反應(yīng)、涉及硫醇化試劑的反應(yīng)以及碳二亞胺介導(dǎo)的抗體與納米顆粒的綴 合。
[0135] 實施例
[0136] 實施例1.側(cè)向流檢測
[0137] 從用山羊抗兔IgG(測試線）和生物素-BSA(對照線）劃線的硝酸纖維素膜 (Millipore Hi Flow plus 90)制備了側(cè)向流測試條帶（寬4mm)。將條帶裝入塑料盒中并向 樣品板添加金綴合劑樣品（80μ1)。使塑料盒靜置30分鐘，然后用ESE-Quant GOLD讀取器 (QIAGEN)讀數(shù)。每個樣品都添加有固定量的與對照線結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素-金（Innova biosciences-產(chǎn)品編碼：250-0200)，以檢驗每個測試條帶已正確地運行且測試線數(shù)據(jù)有