效。
[0138] 實(shí)施例2.熒光檢測(cè)
[0139] 將黑色96孔板(Greiner Bio-One(編碼655077))與50μ1 兔IgG(lyg/孔）在4°C過夜 溫育。將板用TBS/0.1 %BSA在室溫封閉1小時(shí)，并用TBS (洗滌緩沖液)洗滌5次。將熒光抗體 綴合物在TBS/0.1%BSA中連續(xù)稀釋，并將50μ1的等分試樣一式三份地添加至孔內(nèi)。在室溫 溫育1小時(shí)后，將板洗滌5次，并使用帶有i-Control 1.4軟件的Tecan Infinite Μ200平板 讀取器以適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)/發(fā)射設(shè)定（焚光素，490nm/535nm;藻紅蛋白，535nm/575nm)讀取焚光 發(fā)射。將熒光數(shù)據(jù)作為綴合物稀釋度的函數(shù)作圖。為了比較在不同實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的添加劑的 結(jié)果，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為占對(duì)照值（即，在沒有任何測(cè)試添加劑存在的情況下制備的綴合物的信 號(hào)）的百分比。
[0140] 實(shí)施例3.與羧基化金的綴合反應(yīng)
[0141]在50mM最終濃度的添加劑存在下，對(duì)于每毫升的具有羧基官能團(tuán)的經(jīng)涂布的40nm 納米顆粒（InnovaCoat GOLD，Innova Biosciences)，使用10 · 00D的 10yg山羊抗兔IgG (GAR)。通常，進(jìn)行以下添加來設(shè)置反應(yīng):將40μ1的40nm InnovaCoat (羧基化)金納米顆粒與 4μ1 0.1mg/ml GAR、20yl水和80μ1 的含lOOmM添加劑的lOOmM MES緩沖液(pH 5.0) -起溫育 5分鐘。隨后，添加16μ的ImM EDC，在22°C溫育10分鐘后，添加20μ1的10X TBS/1 %Tween20和 20μ 1水以得到20D綴合物。
[0142] 在需要時(shí)將金綴合物與兔IgG(最終濃度為50ng/ml)于22°C混合。綴合物為0.20D 終濃度（即，儲(chǔ)備綴合物的1/10稀釋物）。將樣品如實(shí)施例1所述在側(cè)向流測(cè)試條帶上一式三 份運(yùn)行。
[0143] 實(shí)施例4.不同添加劑對(duì)Lightning-Link熒光素綴合反應(yīng)的影響
[0144] 反應(yīng)根據(jù)制造商的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來進(jìn)行，不同之處在于：在使用熒光素 Lightning-Link 試劑盒(產(chǎn)品編碼 707-0010, Innova Biosciences ， 英國(guó)）進(jìn)行的山羊抗兔 IgG 的綴合反 應(yīng)中，以至多50mM濃度的包括添加劑。根據(jù)實(shí)施例2中所述的規(guī)程對(duì)綴合物進(jìn)行測(cè)試。圖1中 示出了在甘氨酸甜菜堿存在時(shí)制備的綴合物的劑量響應(yīng)曲線，并且，在以下化合物存在時(shí) 制備的綴合物（1/100稀釋)的占對(duì)照值的％ (括號(hào)中的值)為:與無添加劑的對(duì)照（100%)相 比，脯氨酸(53%)，甘氨酸甜菜堿(98%)，N，N-二甲基甘氨酸(96%)，2_吡啶甲酸(83%)。 [0145]實(shí)施例5.三(羥甲基）甲基甘氨酸在Light-Link藻紅蛋白綴合反應(yīng)中的效果 [0 146] 方法如實(shí)施例4中所述，不同之處在于利用Lightning-Link PE綴合試劑盒(703-〇〇〇5)將山羊抗兔IgG與熒光蛋白藻紅蛋白（PE)綴合。在三(羥甲基）甲基甘氨酸存在時(shí)制備 的藻紅蛋白綴合物的劑量響應(yīng)曲線如圖2所示。三(羥甲基）甲基甘氨酸在所測(cè)試的濃度范 圍內(nèi)對(duì)Lightning-Link PE綴合反應(yīng)幾乎沒有影響。在此情形中，以最高濃度的三(輕甲基） 甲基甘氨酸(50mM)制備的綴合物給出了占對(duì)照值(沒有添加劑存在時(shí)）的91%的信號(hào)。
[0147] 實(shí)施例6.添加劑對(duì)異硫氰酸酯反應(yīng)的影響
[0148] 將40yg的10mg/ml兔IgG與在含50mM添加劑(甘氨酸甜菜堿、檸檬酸或甘氨酸中的 一種）的80mM CHES緩沖液(pH 9.0)中的50μΜ FITC在暗處于22°C溫育過夜。將綴合物在 HH0柱(GE Healthcare)上于TBS緩沖液中脫鹽，并在280nm和495nm確定洗脫出的溶液的吸 光度值。圖3中顯示了在不同的添加劑的存在下抗體染料綴合物的染料摩爾數(shù)與蛋白摩爾 數(shù)之比。甘氨酸顯示出顯著的干擾，而甘氨酸甜菜堿和檸檬酸則給出與對(duì)照（即，沒有添加 劑)類似的結(jié)果。
[0149] 實(shí)施例7.添加劑對(duì)NHS酯反應(yīng)的影響
[0150]將40yg的10mg/ml兔IgG與在含50mM的不同添加劑中的一種（來自甘氨酸甜菜堿、 檸檬酸或甘氨酸）的80mM磷酸鈉溶液(pH 8.0)中的50μΜ熒光素-NHS染料在暗處于22°C溫育 30分鐘。將綴合物在用TBS緩沖液平衡的HHO柱上脫鹽，并在280nm和495nm確定洗脫出的溶 液的吸光度值。圖4中顯示了在不同添加劑存在下抗體染料綴合物的染料摩爾數(shù)與蛋白摩 爾數(shù)之比。甘氨酸甜菜堿和檸檬酸給出了與對(duì)照(無添加劑)類似的結(jié)果，而甘氨酸則顯示 出顯著的干擾。
[0151] 實(shí)施例8.添加劑對(duì)于硫醇化試劑2-亞氨基四氫噻吩的影響
[0152] 將含80μg/ml DTNB和50mM添加劑(甘氨酸甜菜堿、檸檬酸或甘氨酸）的lOOmM磷酸 鈉溶液(pH 8.0)的200μ1樣品一式三份添加至透明96孔板(Greiner Bio-One，編碼655077) 中。向各孔添加20μ1的2mM 2-亞氨基四氫噻吩并快速混合，使用Tecan Infinite M200平板 讀取器用i-Control 1.4軟件持續(xù)30分鐘每分鐘讀取405nm處的吸光度值。來自2-亞氨基四 氫噻吩的巰基釋放如圖5中所示。該圖顯示出2-亞氨基四氫噻吩的開環(huán)反應(yīng)中的巰基釋放。 在對(duì)照反應(yīng)中，吸光度隨著試劑被水所水解而穩(wěn)定地線性增加。在甜菜堿或檸檬酸的存在 下該速率未增加（曲線與對(duì)照曲線疊加）。在甘氨酸存在下，發(fā)生快速水解和2-亞氨基四氫 噻吩的開環(huán)。甘氨酸甜菜堿和檸檬酸的釋放巰基的速度均不比對(duì)照反應(yīng)(無添加劑）中所觀 察到的更快。升高的基線可能是由于已知的2-亞氨基四氫噻吩在堿性pH值下對(duì)水解的敏感 性。
[0153] 實(shí)施例9.使用鎖定緩沖劑和高pKa組分來中和CFEB樣品
[0154] 向3ml甘氨酸甜菜堿(pH 2.25)中添加"鎖定"緩沖劑(30μ1的1M Hepes，pH 7.5)， 隨后反復(fù)添加1〇μ1的高pKa組分(0.5M CHES緩沖液，pH 9.5)。每次添加后測(cè)定pH。在添加70 μ1、80μ1和90μ1的CHES緩沖液(pH 9.5)后，混合物的?田直為7.25、7.45和7.6。圖6顯示出采 用和不采用鎖定緩沖劑時(shí)的完全pH曲線。該圖顯示出在采用(實(shí)心圓）或不采用(空心圓）鎖 定緩沖劑(3(^1的謂！^68，？!17.5)并隨后反復(fù)添加1(^1的0.51〇^緩沖液(？!19.5)時(shí) 對(duì)3ml CFEB (甜菜堿，pH 2.25)的中和情況。添加鎖定緩沖劑將pH升高了約1個(gè)pH單位，因此 曲線具有不同的起始位置。更重要的是，雖然添加了 pH 9.5的中和緩沖液，但鎖定緩沖劑 (pKa 7.5)在pH 7至pH 8之間抵抗pH變化，使得易于將pH調(diào)節(jié)至pH 7.5附近的任意值。在不 存在鎖定緩沖劑時(shí)，在單次添加1(^1的〇^5緩沖液(從9(^1至10(^1)時(shí)觀察到從?!14.87到 pH 8.19的急遽變化。
[0155] 實(shí)施例10.展示柱
[0156] 將山羊抗小鼠 Sepharose珠裝填于一次性柱中（0.5ml裝填體積）。在與TBS中的小 鼠 IgG樣品溫育2小時(shí)后，將柱用1 OmM磷酸鈉/150mM NaCl (pH 8.0)洗滌，然后用1 OmM甜菜堿 (口!12.3)洗脫。收集10(^1的級(jí)分，并立即用11.以1的含有5〇11^他?68(鎖定緩沖劑)和9〇11^ CHES(高pKa組分）的10X緩沖液A來中和。所述10X緩沖液A通過將適當(dāng)體積的1M Hepes (pH 7.5)、0.5M CHES(pH 9.5)和水混合而制備?？贵w(處于甜菜堿中）與中和緩沖液的體積比產(chǎn) 生了最終為5mM的鎖定緩沖劑濃度和7.1的pH。作為另一選擇，可以用11. ΙμL的10X緩沖液B (30禮！1叩^和10511110^緩沖液)來中和洗脫的級(jí)分，以得到最終?!1為7.55的更弱緩沖的 抗體制備物(即，鎖定緩沖劑3mM)。
[0157] 在50mM MES緩沖液(pH 5.0)中將純化的抗體（lyg)綴合至羧基化的InnovaCoat Gold納米顆粒（Innova Biosciences)，并使用山羊抗小鼠 IgG作為橋連試劑，在用小鼠 IgG 劃線的側(cè)向流膜上進(jìn)行測(cè)試(與實(shí)施例1類似，但在測(cè)試線上采用不同的抗體）。來自不同實(shí) 驗(yàn)的綴合物的側(cè)向流信號(hào)為165至277單位，相比之下，沒有經(jīng)過色譜處理的小鼠 IgG的值為 193單位，而不存在橋連試劑的對(duì)照的值為0單位。
[0158] 綴合反應(yīng)中使用的50mM MES緩沖液(pH 5.0)(終濃度)處于其可用緩沖范圍的極 限，但能輕易地克服濃度為3mM和5mM的鎖定緩沖劑;事實(shí)上，約40mM MES就足以將兩個(gè)樣品 的pH降低至pH 5.0。在最終鎖定緩沖劑濃度為僅ImM Hepes(且CHES為10.5mM)時(shí)，僅需要 22mM MES來將pH降低至最終反應(yīng)pH 5.0。
[0159] 表1.
[0160]
[0161]
[0162]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種將分離的抗體綴合至標(biāo)記物或衍生化試劑的方法，所述方法包括:在包含除甘 氨酸以外的一元羧酸緩沖化合物的緩沖體系中，使所述抗體與經(jīng)活化的標(biāo)記物或經(jīng)活化的 衍生化試劑接觸，或者在抗體綴合試劑的存在下使所述抗體與所述標(biāo)記物或衍生化試劑接 觸;所述一元羧酸緩沖化合物帶有處于在α或β位的氨基取代基。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體綴合試劑或經(jīng)活化的標(biāo)記物包含碳二亞 胺、Ν-羥基琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞胺、異硫氰酸酯或硫醇化試劑。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物還包含一個(gè)或多個(gè)非 氨基取代基或者不包含其它取代基。4. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一元羧酸的氨基取代基是仲氨基 或叔氨基，或者是季銨。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述氨基取代基是季銨取代基。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物是甜菜堿。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述甜菜堿是Ν，Ν，Ν-三甲基甘氨酸。8. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物是伯氨基酸。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述伯氨基酸是丙氨酸、β-丙氨酸或2-氨基丁酸。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物是脯氨酸、三(羥甲基）甲 基甘氨酸、Ν-甲基甘氨酸、Ν，Ν-二甲基甘氨酸或2-吡啶甲酸。11. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物的羧基的 pKa為1至4。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物的羧基的pKa為1.5至 3.5〇13. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物的氨基的 pKa大于8。14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物的氨基的pKa大于9。15. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物以小于 200mM的濃度存在。16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物的濃度小于lOOmM。17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述一元羧酸緩沖化合物的濃度小于50mM。18.