凈工作臺(tái)和雙手。②用吸管吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，用PBS清洗3次。③ 加入0.02 %EDTA-0.25%胰蛋白酶液2mL進(jìn)行消化，靜置約5分鐘，并不時(shí)在倒置相差顯微鏡 下觀察，當(dāng)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片時(shí)，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰蛋白 酶的作用。④用滴管將已經(jīng)消化的細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液，吸入10mL離心管中平衡離心（1000 轉(zhuǎn)/分)5分鐘。⑤棄去上清液，加入2mL培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，1:2~3 分裝入新培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液適量于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0059] 2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
[0060] 倒置顯微鏡觀察：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC3和DU145細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24h后加 入10.Omg · Γ1，化合物（I)處理24,48，72h后分別在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變并 記錄。
[0061] 3、細(xì)胞毒試驗(yàn)(CCK-8法）
[0062] ①培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照3 X104個(gè)細(xì)胞/孔接種于 96孔板，每孔加0. lmL培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37 °C、含5 %C02氣體的培養(yǎng)箱中。②試驗(yàn)分組:設(shè) 陰性對(duì)照組(有細(xì)胞但不加藥，0.1%DMS0)，空白對(duì)照組(無細(xì)胞僅有培養(yǎng)液），化合物（I)分 別2 · 5mg/L，5 · Omg/L，10 · Omg/L和20 · Omg/L共6組。③24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，分別 按上述試驗(yàn)分組向96孔板內(nèi)加藥，每組設(shè)6-8個(gè)重復(fù)孔。④加藥后將96孔板移入37°C、含5% C02氣體的培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48和72小時(shí)。⑤每組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每孔加入CCK-810yL， 37 °C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后酶標(biāo)儀檢測(cè)450每孔的吸光度(0D)值，測(cè)定波長(zhǎng)為450nm，參 考波長(zhǎng)為600nm。⑥按照以下公式計(jì)算出細(xì)胞存活率(cell viability)，然后繪制成圖表， 存活率為50%時(shí)的值即為IC5Q。細(xì)胞存活率（％ ) = [ (As-Ab)/(Ac-Ab) ] X 100%。其中As為試 驗(yàn)孔，Ac為對(duì)照孔，Ab為空白孔。
[0063] 4、集落形成試驗(yàn)
[0064]①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以3 X 102個(gè)接種于6孔板，每孔加2mL培養(yǎng)基，常規(guī)培 養(yǎng)于37°C、含5%C02氣體的培養(yǎng)箱中。②24h后觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，分別加入不同濃度 (0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L)化合物（I)處理，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。③加藥后將6孔板移入37 °C、含5%C〇2氣體的培養(yǎng)箱中繼續(xù)14天。④10%甲醇固定，Giemsa染色，計(jì)算每孔集落數(shù)（> 50個(gè)細(xì)胞的計(jì)為一個(gè)集落）。⑤計(jì)算集落形成率:集落總數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)X 100%。
[0065]三、結(jié)果及結(jié)論
[0066] 1、化合物（I)氣對(duì)PC3和DU145細(xì)胞形態(tài)的影響
[0067]鏡下見對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，相鄰細(xì)胞融合成片，細(xì)胞呈類圓形或梭形，體積較 大，排列緊密，邊緣光滑，胞質(zhì)飽滿，核膜、核仁等結(jié)構(gòu)輪廓明顯，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速;經(jīng)10.〇mg/L 化合物（I)處理后，細(xì)胞密度逐漸降低，生長(zhǎng)速度明顯減慢至幾乎停滯，細(xì)胞逐漸脫落并漂 浮于培養(yǎng)液中。細(xì)胞體積縮小，胞膜皺縮，成小圓形或不規(guī)則形態(tài)，胞內(nèi)多見小顆粒狀物質(zhì)。 藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?cè)矫黠@。
[0068] 2、細(xì)胞毒試驗(yàn)
[0069]不同濃度化合物（I)對(duì)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145的生長(zhǎng)均有抑制作用。2.5， 5.0，10.0，20.0mg/L化合物（I)作用兩種細(xì)胞24，48和72h后的存活率如下表所示(表1及表 2)。其中，10.0mg/L化合物（I)作用于PC3和DU145細(xì)胞24，45，72h后的細(xì)胞存活率分別為 57.1%，43.3%，24.1%和51.2%，31.6%，21.7% ;2.5,5.0，10.0,20.0mg/L，化合物（I)作 用兩種細(xì)胞72h后的存活率分別為54.3%，37.7%，24.3%，13.2%和52.4%，32.8%， 20.7%，11.2% (見圖5及圖6)。兩因素方差分析示不同濃度與不同時(shí)間處理組之間差別具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.〇5)，提示化合物（I)對(duì)PC3和DU145的生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間濃度依賴。
[0070] 3、集落形成試驗(yàn)
[0071] 試驗(yàn)顯示，對(duì)照組PC3和DU145的集落形成率分別為67.7和64%，而2.5，5.0，10.0， 20.011^/1化合物（1)處理組分別為60.8%，52.3%，37.4%，26.2%和49.6%，33.0%， 26.3%，16.8% (見表3)。這進(jìn)一步證實(shí)了化合物（I)對(duì)PC3和DU145細(xì)胞具有增殖抑制作用。 [0072]結(jié)論，本試驗(yàn)中通過CCK-8法和集落形成試驗(yàn)來驗(yàn)證化合物（I)對(duì)前列腺癌細(xì)胞株 PC3和DU145的作用，且抑制作用具有濃度一一時(shí)間依賴性關(guān)系?；衔铮↖)可能成為晚期前 列腺癌治療中的一個(gè)具有潛力的選擇。
[0073]表1不同濃度化合物(I)作用于PC3后的細(xì)胞存活率

[0079] 化合物（Π )藥理作用試驗(yàn)
[0080] -、材料和儀器
[0081 ] 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3(ArCC-CRL-1435)、前列腺癌細(xì)胞株DU145(ATCC-HTB-81)?；?合物（Π )自制，HPLC歸一化純度大于98%，用二甲基亞礬(DMS0)配制成濃度為1.0g/L的儲(chǔ) 存液備用。CCK-8試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。胎 牛血清(FBS)購(gòu)自Hyelone公司。青/鏈霉素為上海先鋒藥業(yè)產(chǎn)品。胰蛋白酶購(gòu)自華美生物工 程公司。二甲基亞砜（DMS0)購(gòu)自上海華舜生物工程公司。瓊脂（Agarose)、二硫蘇糖醇 (DTT)、苯甲基磺酞氟(PMSF)、四甲基乙二胺（TEMED)為Sigma公司產(chǎn)品。十二烷基磺酸鈉 (SDs)、三氯甲基烷基甲燒(1'1^8)1'1^8-此1、1'1'；[1:01?-100為?1'0111683公司產(chǎn)品。丙稀酞胺、過 硫酸錢(AP)購(gòu)于蘇州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。
[0082] C02細(xì)胞培養(yǎng)箱(ShellLab)，倒置相差顯微鏡(Nikon)，超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備 廠），流式細(xì)胞儀（BD)，F(xiàn)039300A型酶標(biāo)儀（Sunrise)，高壓蒸汽滅菌器（Hirayama HA-300MD)，低溫超速離心機(jī)(Kubota 3740)，萬向搖床(江蘇麒麟醫(yī)用儀器廠TS-92)，電泳儀 (Gibco公司），LXJ-n型離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠），DK600型電熱恒溫水浴箱(上海精密 試驗(yàn)設(shè)備公司），電子天平(METTLER TOLEDO)，臺(tái)式干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）， 紫外分光光度儀(Beckman)。
[0083] 二、試驗(yàn)方法
[0084] 1、細(xì)胞培養(yǎng)與養(yǎng)護(hù)
[0085] 1.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0086]細(xì)胞株培養(yǎng)于腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基 中，另添加谷氨酞胺(2mmo 1/L)和抗生素（100U/青霉素和100mg/L鏈霉素），置37°C、飽和濕 度、含5 % C〇2氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0087] 1.2細(xì)胞傳代
[0088]①于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿貼壁，即可傳代。傳代前用75%酒精擦拭經(jīng) 過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。②用吸管吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，用PBS清洗3次。③ 加入0.02 %EDTA-0.25%胰蛋白酶液2mL進(jìn)行消化，靜置約5分鐘，并不時(shí)在倒置相差顯微鏡 下觀察，當(dāng)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片時(shí)，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰蛋白 酶的作用。④用滴管將已經(jīng)消化的細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液，吸入10mL離心管中平衡離心（1000 轉(zhuǎn)/分)5分鐘。⑤棄去上清液，加入2mL培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，1:2~3 分裝入新培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液適量于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0089] 2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
[0090] 倒置顯微鏡觀察：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC3和DU145細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24h后加 入lO.Omg · I/1，化合物（Π )處理24,48,72h后分別在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變 并記錄。
[0091] 3、細(xì)胞毒試驗(yàn)(CCK-8法）
[0092] ①培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照3 X104個(gè)細(xì)胞/孔接種于 96孔板，每孔加0. lmL培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37 °C、含5 %C02氣體的培養(yǎng)箱中。②試驗(yàn)分組:設(shè) 陰性對(duì)照組(有細(xì)胞但不加藥，0.1%DMS0)，空白對(duì)照組(無細(xì)胞僅有培養(yǎng)液），化合物（Π ) 分別2 · 5mg/L，5 · Omg/L，10 · Omg/L和20 · Omg/L共6組。③24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，分 別按上述試驗(yàn)分組向96孔板內(nèi)加藥，每組設(shè)6-8個(gè)重復(fù)孔。④加藥后將96孔板移入37°C、含 5%C0 2氣體的培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48和72小時(shí)。⑤每組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每孔加入CCK-810 μ L，3 7 °C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后酶標(biāo)儀檢測(cè)4 5 0每孔的吸光度（0 D)值，測(cè)定波長(zhǎng)為 450nm，參考波長(zhǎng)為600nm。⑥按照以下公式計(jì)算出細(xì)胞存活率(cell viability)，然后繪制 成圖表，存活率為50%時(shí)的值即為IC5Q。細(xì)胞存活率（％) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)]X100%。其 中As為試驗(yàn)孔，Ac為對(duì)照孔，Ab為空白孔。
[0093] 4、集落形成試驗(yàn)
[0094]①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以3 X 102個(gè)接種于6孔板，每孔加2mL培養(yǎng)基，常規(guī)培 養(yǎng)于37°C、含5%C02氣體的培養(yǎng)箱中。②24h后觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，分別加入不同濃度 (0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L)化合物（Π )處理，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。③加藥后將6孔板移入37 °C、含5%C〇2氣體的培養(yǎng)箱中繼續(xù)14天。④10%甲醇固定，Giemsa染色，計(jì)算每孔集落數(shù)（> 50個(gè)細(xì)胞的計(jì)為一個(gè)集落）。⑤計(jì)算集落形成率:集落總數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)X 100%。
[0095]三、結(jié)果及結(jié)論
[0096] 1、化合物（Π )氣對(duì)PC3和DU145細(xì)胞形態(tài)的影響
[0097]鏡下見對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，相鄰細(xì)胞融合成片，細(xì)胞呈類圓形