本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)蝦青素的紅酵母工程菌及其構(gòu)建方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：蝦青素(Astaxanthin)是一種萜類天然色素，屬于類胡蘿卜素范疇。蝦青素分子由兩個(gè)末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)通過中間的多烯連接，分子式為C40H52O4。由于末端兩個(gè)β-紫羅蘭酮結(jié)構(gòu)第三位羥基碳原子的手性，蝦青素存在三種立體異構(gòu)體，即(3S,3S')、(3R,3R')、(3R,3S')。蝦青素分子含有共軛雙健、羥基、酮基，既具有親脂性，也具有親水性，這些分子特征賦予蝦青素獨(dú)特的生物學(xué)活性和功能。蝦青素具有強(qiáng)抗氧化作用。蝦青素分子中的共軛雙鍵能夠作為電子供體與生物體內(nèi)的自由基反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定產(chǎn)物，從而終止自由基的破壞性氧化反應(yīng)。除共軛雙鍵外，蝦青素分子的羥基和酮基功能團(tuán)賦予其親水性，對(duì)抗氧化起到重要作用(HusseinG,SankawaU,GotoH,MatsumotoK,WatanabeH.Astaxanthin,acarotenoidwithpotentialinhumanhealthandnutrition.JNatProd,2006,69:443-449)。與其它抗氧化劑不同，蝦青素分子既有親水性又有親脂性，能夠跨過細(xì)胞膜，清除細(xì)胞膜脂雙層內(nèi)部及外部的自由基、單態(tài)氧，終止脂過氧化反應(yīng)，從而對(duì)蛋白質(zhì)、脂類和DNA起到保護(hù)作用(GotoS,KogureK,AbeK,KimataY,KitahamaK,YamashitaE,TeradaH.Efficientradicaltrappingatthesurfaceandinsidethephospholipidmembraneisresponsibleforhighlypotentantiperoxidativeactivityofthecarotenoidastaxanthin.BiochimBiophysActa,2001,1512:251-258；RaoAR,SindhujaHN,DharmeshSM,SankarKU,SaradaR,RavishankarGA.Effectiveinhibitionofskincancer,tyrosinase,andantioxidativepropertiesbyastaxanthinandastaxanthinestersfromthegreenalgaHaematococcuspluvialis.JAgricFoodChem,2013,61:3842-3851)。蝦青素的抗氧化活性是β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃素、角黃素等的10倍以上。除強(qiáng)抗氧化作用外，蝦青素還有多種其它保健功效和潛在的疾病治療作用，主要包括以下幾個(gè)方面：(1)抗炎癥。多項(xiàng)研究表明，蝦青素能抑制眼睛炎癥、緩解眼疲勞(ParkJS,ChyunJH,KimYK,LineLL,ChewBP.Astaxanthindecreasedoxidativestressandinflammationandenhancedimmuneresponseinhumans.NutrMetab(Lond),2010,7:18)。蝦青素還能吸收紫外線，防 止皮膚加厚和老化(HamaS,TakahashiK,InaiY,ShiotaK,SakamotoR,YamadaA,TsuchiyaH,KanamuraK,YamashitaE,KogureK.Protectiveeffectsoftopicalapplicationofapoorlysolubleantioxidantastaxanthinliposomalformulationonultraviolet-inducedskindamage.JPharmSci,2012,101:2909-2916)。除此之外，初步研究表明，蝦青素對(duì)某些其它炎癥有治療效果，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、口腔潰瘍、腕管綜合癥等(KiddP.Astaxanthin,cellmembranenutrientwithdiverseclinicalbenefitsandanti-agingpotential.AlternMedRev,2011,16:355-364)。(2)預(yù)防心腦血管疾病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，蝦青素對(duì)動(dòng)脈缺血、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等有預(yù)防和改善作用(FassettRG,CoombesJS.Astaxanthin:apotentialtherapeuticagentincardiovasculardisease.MarDrugs,2011,9:447-465；Monroy-RuizJ,SevillaMA,CarronR,MonteroMJ.Astaxanthin-enriched-dietreducesbloodpressureandimprovescardiovascularparametersinspontaneouslyhypertensiverats.PharmacolRes,2011,63:44-50)。(3)抗腫瘤活性。與角黃素和β-胡蘿卜素相比，蝦青素具有顯著的抗癌活性(ChewBP,ParkJS,WongMW,WongTS.Acomparisonoftheanticanceractivitiesofdietarybeta-carotene,canthaxanthinandastaxanthininmiceinvivo.AnticancerRes,1999,19:1849-1853)。蝦青素可以抑制皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)(TanakaT,MakitaH,OhnishiM,MoriH,SatohK,HaraA.Chemopreventionofratoralcarcinogenesisbynaturallyoccurringxanthophylls,astaxanthinandcanthaxanthin.CancerRes,1995,55:4059-4064；PalozzaP,TorelliC,BoninsegnaA,SimoneR,CatalanoA,MeleMC,PicciN.Growth-inhibitoryeffectsoftheastaxanthin-richalgaHaematococcuspluvialisinhumancoloncancercells.CancerLett,2009,283:108-117；AmbatiRR,PhangSM,RaviS,AswathanarayanaRG.Astaxanthin:sources,extraction,stability,biologicalactivitiesanditscommercialapplications--areview.MarDrugs,2014,12:128-152)。蝦青素的傳統(tǒng)用途是著色劑，用作魚類的飼料添加劑，提升魚的色澤和抗病能力。隨著蝦青素生物學(xué)功能研究的發(fā)展，該產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域正在擴(kuò)展。近期，可供人口服的蝦青素膠囊(Nutrex)以及化妝品(ASTALIFT)陸續(xù)問世。蝦青素的市場(chǎng)也正在擴(kuò)大，據(jù)BCCresearch估計(jì)，到2015年蝦青素的市場(chǎng)額度會(huì)達(dá)到2.5億美元(SchmidtI,ScheweH,GasselS,JinC,BuckinghamJ,HumbelinM,SandmannG,SchraderJ.BiotechnologicalproductionofastaxanthinwithPhaffiarhodozyma/Xanthophyllomyces dendrorhous.ApplMicrobiolBiotechnol,2011,89:555-571)。另有預(yù)測(cè)，到2020年蝦青素的市場(chǎng)額度會(huì)達(dá)到15億美元。目前，蝦青素的來源以化學(xué)合成為主，化學(xué)合成的蝦青素主要用作飼料添加劑，不能供人使用。天然蝦青素存在于蝦蟹殼、藻類等海洋生物和紅酵母等微生物。天然蝦青素可供人使用，但產(chǎn)量非常有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，而且價(jià)格昂貴。從蝦蟹等甲殼類水產(chǎn)品廢棄物提取蝦青素，面臨原料來源和收集方面的困難，產(chǎn)量有限。通過藻類和酵母菌培養(yǎng)獲得蝦青素，成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的研發(fā)熱點(diǎn)，具有很好的開發(fā)前景。紅發(fā)夫酵母(Phaffiarhodozyma/Xanthophyllomycesdendrorhous)能夠合成多種類胡蘿卜素，其中蝦青素比例最高，可以達(dá)到85％。此外，紅發(fā)夫酵母在生長(zhǎng)速度、細(xì)胞培養(yǎng)密度、抗污染等方面具有突出優(yōu)勢(shì)。因此，紅發(fā)夫酵母被認(rèn)為是蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)的重要潛在細(xì)胞工廠。但是，野生型紅發(fā)夫酵母的蝦青素含量低于細(xì)胞干重的0.1％。傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變和培養(yǎng)優(yōu)化，在一定程度上提高了紅發(fā)夫酵母的蝦青素含量，有研究將突變菌的蝦青素含量提高到細(xì)胞干重的0.47％(delaFuenteJL1,Rodríguez-SáizM,SchleissnerC,DíezB,PeiroE,BarredoJL.High-titerproductionofastaxanthinbythesemi-industrialfermentationofXanthophyllomycesdendrorhous.JBiotechnol,2010,148:144-146)。除了傳統(tǒng)誘變和培養(yǎng)優(yōu)化，遺傳改造是提高紅發(fā)夫酵母蝦青素含量的另一種方法。隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化蝦青素合成途徑具備了可實(shí)現(xiàn)性，這些新方法的應(yīng)用有望大大提高紅發(fā)夫酵母的蝦青素產(chǎn)量，推動(dòng)該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程和市場(chǎng)供給。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種高產(chǎn)蝦青素的紅酵母工程菌種以及構(gòu)建方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：一種高產(chǎn)蝦青素紅酵母工程菌，紅酵母工程菌為紅發(fā)夫酵母菌株SXD，分類學(xué)命名為Xanthophyllomycesdendrorhous，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.10519，保藏日期為2015年2月4日，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。一種高產(chǎn)蝦青素紅酵母工程菌的構(gòu)建方法：以紅發(fā)夫酵母CBS6938菌株作為宿主，通過代謝工程方式，將提高紅發(fā)夫酵母乙酰輔酶A合成、降低甾體類物質(zhì)合成以及提高蝦青素合成途徑代謝通量的基因元件表達(dá)盒轉(zhuǎn)化宿主，進(jìn)而獲得高產(chǎn)蝦青素紅酵母工程菌。優(yōu)選為：通過代謝工程方式，在宿主CBS6938中過量表達(dá)紅發(fā)夫酵母蝦青素合成酶基因CrtS、細(xì)胞色素P450還原酶基因CrtR、GGPP合成酶基因CrtE和茄紅素合成酶基因CrtYB；同時(shí)表達(dá)釀酒酵母HMG-CoA還原酶基因HMGR，并且敲除紅發(fā)夫酵母C22-甾醇去飽和酶基因CYP61，表達(dá)細(xì)菌丙酮酸脫氫酶基因LpdA、AceE和AceF基因，進(jìn)而獲得高產(chǎn)蝦青素紅酵母工 程菌。所述高產(chǎn)蝦青素紅酵母工程菌基因的整合位點(diǎn)為紅發(fā)夫酵母基因組rDNA、CYP61或/和DHS3位點(diǎn)。所述高產(chǎn)蝦青素紅酵母工程菌的啟動(dòng)子和終止子分別為紅發(fā)夫酵母基因ADH4、TPI、ACT、TEF1、GPD、GDH或ACT中任意的啟動(dòng)子和終止子。所述高產(chǎn)蝦青素紅酵母工程菌的抗性篩選標(biāo)記為遺傳霉素(G418)、潮霉素(Hgr)、放線菌酮(CHX)、博萊霉素(BLM)中的一種或幾種的組合。其中，遺傳霉素(G418)為100-500μg/ml、潮霉素(Hgr)為50-400μg/ml、放線菌酮(CHX)為2-10μg/ml、博萊霉素(BLM)為100-500μg/ml。本發(fā)明所具有優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過代謝工程方法獲得紅發(fā)夫酵母工程菌株SXD，顯著提高了紅發(fā)夫酵母蝦青素合成途徑的代謝通量。。所獲得的紅發(fā)夫酵母工程菌株SXD的最高蝦青素含量為4.4mg/g細(xì)胞干重，經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)，該菌株的蝦青素含量達(dá)到7.1mg/g細(xì)胞干重，最大生物量為83.8g/L，具有工業(yè)開發(fā)前景。并且，SXD菌株未經(jīng)任何誘變處理，后續(xù)借助誘變育種手段繼續(xù)提高蝦青素產(chǎn)量的空間很大，有望繼續(xù)降低酵母蝦青素生產(chǎn)成本。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的蝦青素合成代謝改造圖；其中，cytoPDH代表基因LpdA、AceE和AceF；HMGR代表HMG-CoA還原酶基因；CrtE代表GGPP合成酶基因；CrtYB代表茄紅素合成酶基因；CrtS代表蝦青素合成酶基因；CrtR代表細(xì)胞色素P450還原酶基因；CYP61代表C22-甾醇去飽和酶基因。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的蝦青素HPLC檢測(cè)圖；其中，橫坐標(biāo)為樣品的保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為測(cè)試樣品的響應(yīng)強(qiáng)度(mAu)，蝦青素出峰時(shí)間為2.483min。圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的紅發(fā)夫酵母菌株的蝦青素含量圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1、質(zhì)粒構(gòu)建1.1基因元件的克隆1)基因ADH2、ALD6、CrtE、CrtYB、CrtS和CrtR的獲得：采用玻璃珠破碎法提取紅發(fā)夫酵母的基因組DNA，分別以紅發(fā)夫酵母的基因組DNA作為模板，并分別以表1中記載的作為各基因的引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶擴(kuò)增基因，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系皆為25ul(2×KAPAMix,12.5ul；10uM引物各0.5ul；模板1ul；加水補(bǔ)至25ul)，即得到各基因序列。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；98℃變性20秒、60-72℃退火15秒、72℃延伸，延伸時(shí)間按照15秒每kb計(jì)算，循環(huán)數(shù)為29-35；72℃延伸6分鐘。2)基因ACS、PHK和PTA的合成：大腸桿菌乙酰輔酶A合成酶基因ACS、 黑曲霉磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因PHK、枯草芽孢桿菌磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因PTA，由生工生物工程(上海)有限公司通過基因合成獲得。3)基因LpdA、AceE、AceF以及基因HMGR的獲得：分別以大腸桿菌基因組作為模板，表1中記載的作為各基因的引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶擴(kuò)增基因，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系皆為25ul[與步驟1.1，1)中記載一致]，即分別獲得LpdA、AceE、AceF各基因序列。其中，擴(kuò)增條件以及擴(kuò)增體系的用量與上述步驟1)中記載的一致。以釀酒酵母基因作為模板，表1中記載的作為各基因的引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶擴(kuò)增基因，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25ul[與步驟1.1，1)中記載一致]，即獲得基因HMGR序列。其中，擴(kuò)增條件以及擴(kuò)增體系的用量與上述步驟1)中記載的一致。表1、基因引物序列引物名稱引物序列ADH2-FATTAACGGTACCGTAATACACAATGTCTATTCCADH2-RAGACATGCTAGCTCCGCTTATTTAGAAGTGTCALD6-FCAAACACCCGGGATCAGAATACAATGACTAAGCALD6-RGCAGGTGGATCCATTACAACTTAATTCTGACCrtE-FGGAACAGAATTCATGGATTACGCGAACATCCTCCrtE-RGAATATGGATCCTCACAGAGGGATATCGGCTAGCCrtYB-FGTTACTGGTACCATGACGGCTCTCGCATATTACCCrtYB-RTCTTCCTCCGGATTACTGCCCTTCCCATCCGCCrtS-FTACTTTACCGGTATGTTCATCTTGGTCTTGCTCCrtS-RTGAAGAGGATCCTCATTCGACCGGCTTGACCTGCrtR-FTATCCACAATTGATGGCCACACTCTCCGATCTTGCrtR-RAAGTCGGCTAGCCTACGACCAGACGTCCATCAACLpdA-FCTCAATCGAGGCATTCAACCATGAGTACTGAAATCAAAACTCLpdA-RTGTGAGAGAGGCGGGGTAATTTACTTCTTCTTCGCTTTCGAceE-FAGCTCTCGAGAACCCTTAATACATTCTGAAGCAACCAGACAceE-RATCATGGTCAGACCATGATTACGCCTTGATCAceF-FAATCATGGTCTGACCATGATTACGCCACGAAceF-RGGTGTCTCCTACAGCACAGATACGTCATTCTAGTCACTCTTACCHMGR-FCAGATCCACTAGTGGCCTATTACGTCATTCTAGTCACTCTTACHMGR-RGATGAGCCAGTACTTGTCCGACGAATCTATTTATTACGTCTAATG1.2啟動(dòng)子和終止子元件的克隆1)ADH4、TPI、ACT、TEF1、GPD和GDH啟動(dòng)子的克?。翰捎貌Ａе槠扑榉ㄌ崛〖t發(fā)夫酵母的基因組DNA，以紅發(fā)夫酵母的基因組DNA作為模板，并分別以表2中記載作為引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶擴(kuò)增啟動(dòng)子，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系皆為25ul(與步驟1.1，1)中記載一致)，即得到基因ADH4、TPI、ACT、TEF1、GPD和GDH的啟動(dòng)子序列。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；98℃變性20秒、60-72℃退火15秒、72℃延伸，延伸時(shí)間按照15秒每kb計(jì)算，循環(huán)數(shù)為29-35；72℃延伸6分鐘。2)ACT、GPD和GDH終止子的克隆：與啟動(dòng)子的克隆類似，以紅發(fā)夫酵母的基因組DNA為模板，并分別以表3中記載作為引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶擴(kuò)增終止子，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系皆為25ul(與步驟1.1，1)中記載一致)，即得到基因ACT、GPD和GDH的終止子序列。其中，擴(kuò)增條件以及擴(kuò)增體系的用量與上述步驟1)中記載的一致。表2、啟動(dòng)子引物序列表3、終止子引物序列引物名稱引物序列Tact-FtctattcatcTAAGTCAACAAAGTCTTTCTATCTact-RgctatgaccatgattacgccACGAATCTATTTATTACGTCTAATGTgpd-FgaaccccacaTCCGGAACGGTTCTCTCCAATgpd-RgctatgaccatgattacgccTTGATCAGATAAAGATAGAGATTTTTTTTTGGGTgdh-FgcattcaaccATTACCCCGCCTCTCTCACATTCTgdh-RgctatgaccatgattacgccTTGCATGTGGGCAAGCTCGC1.3抗性基因元件的克隆1)Hgr、G418和BLM抗性基因的克隆遺傳霉素(G418)抗性基因的獲得是以質(zhì)粒pUG6(EUROSCARF贈(zèng)送)作為基本骨架，其自身攜帶遺傳霉素(G418)抗性基因。潮霉素(Hgr)抗性篩選標(biāo)記基因的獲得是以質(zhì)粒pAG32(EUROSCARF贈(zèng)送)為模板，以表4中記載的作為引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶，25ul反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增潮霉素(Hgr)抗性篩選標(biāo)記基因。博萊霉素(BLM)抗性篩選標(biāo)記基因的獲得是以質(zhì)粒pSH65(EUROSCARF贈(zèng)送)為模板，以表4中記載的作為引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶，25ul反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增博萊霉素(BLM)抗性篩選標(biāo)記基因。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；98℃變性20秒、60-72℃退火15秒、72℃延伸，延伸時(shí)間按照15秒每kb計(jì)算，循環(huán)數(shù)為29-35；72℃延伸6分鐘。表4.抗性基因引物序列2)CHX抗性基因的合成放線菌酮(CHX)抗性篩選標(biāo)記基因由生工生物工程(上海)有限公司通過DNA合成獲得(參考:KimIG,NamSK,SohnJHetal.CloningoftheRibosomalProteinL41GeneofPhaffiarhodozymaandItsUseasaDrugResistanceMarkerforTransformation.ApplEnvironMicrobiol,1998,64:1947-1949.)。1.4DNA同源重組片段的克隆采用玻璃珠破碎法提取紅發(fā)夫酵母的基因組DNA，以獲得基因組DNA為模板，分別以表5中記載的作為引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚 合酶，25ul反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增分別得到同源重組片段rDNA、CYP61和DHS3。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；98℃變性20秒、60-72℃退火15秒、72℃延伸，延伸時(shí)間按照15秒每kb計(jì)算，循環(huán)數(shù)為29-35；72℃延伸6分鐘。表5、同源重組片段引物序列引物名稱引物序列DHS3-FGAGCCGATTGAGGTTGTTTGDHS3-RCAATCCGTCGTCAAGATCGTCCYPUP-FacgatttaggtgacactataCTTCTCAACACGTACCAGCCYPUP-RattaagggttgtcgacctgcGGAACACACTGAATGCGCCYPDN-FgagctccagcCGGACAAGTACTGGCTCATCCYPDN-RtatcgaaattaatacgactcCGGCACGGTGTAGTCAGArDNA1-FtaatttcgatCTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCrDNA1-RaatgcaggttaacctggcttcccgggTGCTTTCGATATCCTATGGCrDNA2-FcagctgaagcttcgtacgctcccgggTAGGTGAACCTGCGGAAGGArDNA2-RgttgtcgacctgcGTTCAGCGGGTAGTCCTACC1.5質(zhì)粒的組裝構(gòu)建所有質(zhì)粒的構(gòu)建以質(zhì)粒pUG6(EUROSCARF贈(zèng)送)為基本骨架，表1-7中記載序列為引物，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶，25ul反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增質(zhì)?；竟羌芷?、目的基因、啟動(dòng)子、終止子、抗性基因、同源片段，應(yīng)用GibsonAssembly方法和試劑盒(NewEnglandBiolabs)將pUG6質(zhì)粒骨架與目的基因、啟動(dòng)子、終止子、抗性基因和同源片段組裝成完整質(zhì)粒(參見表6)。每個(gè)質(zhì)粒包含一種抗性基因、一種同源片段、一至三個(gè)目的基因，每個(gè)目的基因帶有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子。以構(gòu)建pCrtS質(zhì)粒為例：(引物可根據(jù)表1-7確認(rèn))1)以質(zhì)粒pUG6(EUROSCARF贈(zèng)送)為基本骨架，分別以pUG6和紅發(fā)夫酵母基因組DNA為模板，以表7所記載的pUG6-F/R、TEF1-F/R和GPD-F/R為引物，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒骨架片段、TEF啟動(dòng)子片段和GPD終止子片段，將三個(gè)DNA片段應(yīng)用GibsonAssembly方法組裝在一起，獲得質(zhì)粒pUG6-PTEF-TGPD。DNA片段濃度控制在100-200ng每個(gè)反應(yīng)，反應(yīng)體系為20微升，裝配條件為50℃，1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取2微升轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆由菌落PCR和DNA測(cè)序驗(yàn)證篩選獲得。2)分別以pUG6-PTEF-TGPD和紅發(fā)夫酵母基因組DNA為模板，以表7所記載的pTG-F/R和CrtS2-F/R為引物，PCR擴(kuò)增帶有啟動(dòng)子和終止子的質(zhì)粒骨架片段和CrtS基因，將兩個(gè)DNA片段應(yīng)用GibsonAssembly方法組裝在一起，得到質(zhì)粒pUG6-PT-CrtS。3)分別以質(zhì)粒pUG6和紅發(fā)夫酵母基因組DNA為模板，以表7所記載 的pCre2-F/R和CYPUP-NF/NR為引物，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒骨架和CYP61上游同源臂，應(yīng)用GibsonAssembly方法組裝在一起，獲得質(zhì)粒pUG6-CYP61UP。4)分別以質(zhì)粒pUG6-CYP61UP、pSH47(EUROSCARF贈(zèng)送)和紅發(fā)夫酵母基因組DNA為模板，以表7所記載的pCYP-F/R、CREN-F/R和CYPDN-NF/NR為引物，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒骨架、Cre酶基因和CYP61下游同源臂，應(yīng)用GibsonAssembly方法組裝在一起，獲得質(zhì)粒pUG6-CYP61UP-CYP61ND，記為pUG6-CYP61。5)分別以質(zhì)粒pUG6-CYP61和pUG6-PT-CrtS為模板，以表7所記載的pCYP2-F/R和CrtS-setF/setR為引物，PCR擴(kuò)增pUG6-CYP61質(zhì)粒骨架和帶有啟動(dòng)子終止子的CrtS基因，應(yīng)用GibsonAssembly方法組裝在一起，獲得質(zhì)粒pUG6-CYP61-PT-CrtS，記為pCrtS。表6所記載質(zhì)粒的構(gòu)建與pCrtS質(zhì)粒的組裝類似，即應(yīng)用GibsonAssembly方法將目的基因、啟動(dòng)子、終止子、同源片段和抗性基因整合到一個(gè)質(zhì)粒上。表6、質(zhì)粒描述質(zhì)粒名稱特征整合位點(diǎn)pCrtSCrtS,HgrCYP61pStHCrtS,tHMGR,HgrCYP61pSRCrtS,CrtR,HgrCYP61pCrtECrtE,G418rDNApEYBCrtE,CrtYB,G418rDNApKAPHK,PTA,BLMDHSpA3ADH2,ALD6,ACS,BLMDHSpPDHLpdA,AceE,AceF,BLMDHS表7.構(gòu)建質(zhì)粒pCrtS的引物序列實(shí)施例2、紅發(fā)夫酵母工程菌的構(gòu)建2.1表達(dá)盒的獲得以表6所記載的質(zhì)粒pCrtS為模板，以表7記載的CYPUP-NF和CYPDN-NR為引物，應(yīng)用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶，通過PCR擴(kuò)增CrtS-Hgr-CYP61表達(dá)盒。以表6所記載的質(zhì)粒pCrtE為模板，以表5記載的rDNA1-F和rDNA2-R為引物，應(yīng)用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶，通過PCR擴(kuò)增CrtE-G418-rDNA表達(dá)盒。應(yīng)用SmaI分別酶切表6所記載的質(zhì)粒pStH和pSR，獲得表達(dá)盒CrtS-tHMGR-Hgr-CYP61或CrtS-CrtR-Hgr-CYP61。應(yīng)用AflII分別酶切表6所記載的質(zhì)粒pCrtE、pEYB、pKA、pA3和pPDH，獲得表達(dá)盒CrtE-G418-rDNA、CrtE-CrtYB-G418-rDNA或PHK-PTA-BLM-DHS或ADH2-ALD6-ACS-BLM-DHS或LpdA-AceE-AceF-BLM-DHS。2.2紅發(fā)夫酵母轉(zhuǎn)化(1)培養(yǎng)。從YPD平板培養(yǎng)基上挑取菌株CBS6938(可從荷蘭CBS或德國(guó)DSMZ等保藏機(jī)構(gòu)獲得)單菌落，接種于含30mlYPD的250ml搖瓶(YPD成分為葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、)，22℃培養(yǎng)48h。將上述培養(yǎng)的菌液接種于含40mlYPD的250ml搖瓶中，至終濃度為OD600＝0.02，而后于22℃培養(yǎng)至OD600為1.2，約需14-20h。(2)感受態(tài)制備。將培養(yǎng)液離心，用磷酸鉀緩沖液(50mM,pH7.0)重懸，加入DTT，終濃度為25mM，處理15min。然后，4℃離心，用冰冷的蔗糖緩沖液STM(270mMsucrose,10mMTris-HCl,pH7.5,and1mMMgCl2)洗滌兩次，洗滌后細(xì)胞重懸于0.1mlSTM緩沖液，備用。(3)轉(zhuǎn)化。取60μl上述獲得感受態(tài)細(xì)胞，加入10μg基因表達(dá)盒DNA，分別為CrtE-G418-rDNA或CrtS-tHMGR-Hgr-CYP61或CrtS-CrtR-Hgr-CYP61或CrtE-G418-rDNA或CrtE-CrtYB-G418-rDNA或PHK-PTA-BLM-DHS或ADH2-ALD6-ACS-BLM-DHS或LpdA-AceE-AceF-BLM-DHS，電轉(zhuǎn)化，條件為1000Ω,800V,25μF。轉(zhuǎn)化液用600μl冰冷(約0℃)的YPD重懸，22℃孵育2.5h，取100μl涂布于篩選平板。篩選平板的抗性濃度分別為G418200μg/ml、Hgr150μg/ml、BLM200μg/ml、CHX6μg/ml。2.3工程菌株從篩選平板上挑取單菌落，利用PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化結(jié)果，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。利用YM液體培養(yǎng)基(YM液體培養(yǎng)基成分：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物3g/L、麥芽提取物3g/L)，通過搖瓶培養(yǎng)進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化子，獲得工程菌株XD2-1、XD2-2、XD2-3、XD4和SXD。菌株XD2-1由上述可知其是經(jīng)轉(zhuǎn)化由質(zhì)粒pStH來源的表達(dá)盒CrtS-tHMGR-Hgr-CYP61而獲得，即過量表達(dá)基因CrtS，表達(dá)外源基因tHMGR，并且敲除CYP61基因。菌株XD2-2由上述可知其是經(jīng)轉(zhuǎn)化由質(zhì)粒pSR來源的表達(dá)盒CrtS-CrtR-Hgr-CYP61而獲得，即過量表達(dá)基因CrtS和CrtR，并且敲除CYP61基因。菌株XD2-3由上述可知其是經(jīng)轉(zhuǎn)化由質(zhì)粒pEYB來源的表達(dá)盒CrtE-CrtYB-G418-rDNA而獲得，即過量表達(dá)基因CrtE和CrtYB，基因組整合位點(diǎn)為rDNA。菌株XD4由上述可知其是經(jīng)轉(zhuǎn)化由質(zhì)粒pSR和pEYB來源的表達(dá)盒CrtS-CrtR-Hgr-CYP61和CrtE-CrtYB-G418-rDNA而獲得，即過量表達(dá)基因CrtS、CrtR、CrtE、CrtYB，表達(dá)外源基因tHMGR，并且敲除CYP61基因。菌株SXD在XD4基礎(chǔ)上，經(jīng)轉(zhuǎn)化由質(zhì)粒pPDH來源的表達(dá)盒LpdA-AceE-AceF-BLM-DHS而獲得，在菌株XD4的基礎(chǔ)上額外表達(dá)外源基因LpdA、AceE和AceF(圖1)。實(shí)施例3、工程菌株培養(yǎng)產(chǎn)蝦青素3.1菌種搖瓶培養(yǎng)在YM固體平板上分別活化菌株CBS6938、XD4和SXD，22℃培養(yǎng)4天。挑取單菌落分別接種于裝有20mlCNM培養(yǎng)基的250ml搖瓶，22℃培養(yǎng)48h，作為種子培養(yǎng)液。而后將獲得的各種子液按照8％的接種量，將種子培養(yǎng)液分別接種于含30mlCNM培養(yǎng)基的250ml搖瓶，22℃培養(yǎng)3天，然后18℃培養(yǎng)3天，待用。其中，CNM培養(yǎng)基的組成為葡萄糖40g/L，蛋白胨3g/L，酵母提取物1.5g/L，玉米漿1g/L，(NH4)2SO40.8g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO41.5g/L,K2HPO40.3g/L，CaCl2·2H2O0.1g/L，生物素1mg/L，大豆油2ml/L。3.2菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)(以菌株SXD為例)將上述獲得的菌株SXD活化后種子液，在5L發(fā)酵罐中加入3L培養(yǎng)基 CNMB，發(fā)酵控制溶氧在35％左右。發(fā)酵過程中補(bǔ)加濃度為40％的葡萄糖，使發(fā)酵罐中還原糖濃度在3％至4％，直到發(fā)酵結(jié)束。前3天控制溫度為22℃，然后18℃培養(yǎng)3天。其中，CNMB培養(yǎng)基是在CNM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加甘油0.1g/L、CuSO4·5H2O0.05g/L、NaCl0.2g/L、泛酸鈣5mg/L、硫胺素0.5mg/L。接種量為10％。3.3蝦青素的提取取上述獲得的5ml培養(yǎng)液，離心，用體積比為1:1的水和丙酮的混合液洗菌體培養(yǎng)液兩次，放置或氮吹至溶劑揮發(fā)。加入1ml玻璃珠和2mlDMSO，60℃處理15min。漩渦振動(dòng)細(xì)胞，充分破壁。然后，依次加入丙酮、石油醚和20％NaCl各2ml，振蕩，離心使溶液分層，蝦青素等類胡蘿卜素位于石油醚層。吸取色素，真空凍干，待HPLC分析用。3.4蝦青素的測(cè)定總類胡蘿卜素的含量通過分光光度法在A474納米下測(cè)定，消光系數(shù)為1％＝2100。蝦青素含量應(yīng)用HPLC方法測(cè)定，使用AgilentXD-C18反相柱，洗脫緩沖液為乙腈：甲醇＝85:15。在洗脫緩沖液為乙腈：甲醇＝85∶15條件下，HPLC檢測(cè)的蝦青素出峰時(shí)間為2.483min(圖2)。在搖瓶培養(yǎng)條件下，菌株CBS6938、XD2-1、XD2-2、XD2-3、XD4和SXD的蝦青素含量分別為0.15mg/g、1.1mg/g、0.95mg/g、0.83mg/g、2.9mg/g和4.4mg/g(細(xì)胞干重)(圖3)。六株菌搖瓶批次培養(yǎng)的生物量相差不大，在17g/L至20g/L之間。在發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下，菌株SXD的最大蝦青素含量為7.1mg/g(細(xì)胞干重)，最大生物量為83.8g/L。當(dāng)前第1頁1 2 3