本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種EYFP基因標(biāo)記根瘤菌的方法。

背景技術(shù)：

在熒光蛋白基因的實(shí)驗(yàn)過程中，通常將熒光蛋白基因與載體連接后導(dǎo)入受體菌中，由于慢生型大豆根瘤菌需要導(dǎo)入基因組中才可以表達(dá)，采用常規(guī)的方法很難使其有效表達(dá)，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決EYFP基因?qū)肼痛蠖垢鼍募夹g(shù)問題，本發(fā)明提供了一種EYFP基因標(biāo)記根瘤菌的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種EYFP基因標(biāo)記根瘤菌的方法，包括以下步驟：

一、將EYFP-pUC19載體酶切純化后獲得EYFP產(chǎn)物；

二、將EYFP產(chǎn)物與載體pBBR1MCS-2相連，酶切驗(yàn)證，將構(gòu)建的EYFP-pBBR1MCS-2轉(zhuǎn)入E.coli DH5α中；

三、將供體菌EYFP-pBBR1MCS-2、輔助菌pRK2013、受體菌慢生型大豆根瘤菌三親本雜交；

四、同源重組：通過在Km^R的平板上生長(zhǎng)，篩選重組子；

五、PCR驗(yàn)證，確定篩選的重組子已經(jīng)插入到慢生型大豆根瘤菌的基因組中，而基因組中不含有野生株；

六、顯微鏡下觀察EYFP蛋白基因表達(dá)。

本發(fā)明采用同源重組的方法，將EYFP與載體pBBR1MCS-2連接，通過Km^R抗性篩選重組子后，采用PCR法篩選突變株，確保插入染色中，使其穩(wěn)定表達(dá)。

附圖說明

圖1是基因組DNA提取結(jié)果，M：DNA Marker DL10000，1:HW-05基因組DNA；

圖2是酶切純化后獲得獲得EYFP產(chǎn)物，M：DNA Marker DL10000，1：EYFP基因酶切純化產(chǎn)物；

圖3是EYFP-pBBR1MCS-2轉(zhuǎn)化后提取結(jié)果，M：DNA Marker DL10000，1:EYFP-pBBR1MCS-2連接后轉(zhuǎn)化提取結(jié)果；

圖4是克隆酶切鑒定結(jié)果，M：DNA Marker DL10000，1:克隆HindⅢ和BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物；

圖5是重組子篩選，M：DNA Marker DL10000，1:EYFP片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖6是EYFP基因在HW-05中表達(dá)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

以慢生型大豆根瘤菌HW-05為例，本發(fā)明提供的EYFP基因標(biāo)記根瘤菌的方法如下：

一、試驗(yàn)方法

1、HW-05的分離

選取個(gè)大且飽滿的根瘤，用剪刀將其剪下(帶部分根)，將根瘤放在清水中浸泡4～5min，洗去雜質(zhì)，再用95％乙醇浸泡5min后用0.1％的HgCl₂表面滅菌5min，然后用無菌水沖洗10次。在無菌操作的情況下，將單個(gè)根瘤夾破后在YMA培養(yǎng)基上劃線，在28℃的溫箱中培養(yǎng)3～5d后，挑取少許菌體觀察其形態(tài)、大小、透明度、粘稠度、顏色、光澤等特征與標(biāo)準(zhǔn)菌對(duì)比，將獲得的菌體挑入培養(yǎng)基斜面上，繼續(xù)培養(yǎng)觀察，如果菌落無異常，再劃線稀釋反復(fù)分離，直到純化為止。

2、酶切純化后獲得EYFP產(chǎn)物；

將西班牙塞維利亞大學(xué)贈(zèng)予的EYFP-pUC19載體，采用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHI進(jìn)行雙酶切，膠回收獲得EYFP產(chǎn)物。

雙酶切體系(20μl)見表1：

表1

3、純化產(chǎn)物與pBBR1MCS-2連接

將純化的EYFP產(chǎn)物與載體pBBR1MCS-2在16℃連接過夜，反應(yīng)體系如表2：

表2

4、酶切鑒定

限制性內(nèi)切酶鑒定提取的質(zhì)粒。根據(jù)pBBR1MCS-2載體酶切圖譜，選用HindⅢ和BamHI雙酶切篩選陽性重組質(zhì)粒，反應(yīng)條件為37℃水浴4h。反應(yīng)結(jié)束后分別取3μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察酶切結(jié)果，確定是否有外源片段以及插入片段大小是否正確，從而初步判斷是否為重組克隆。

雙酶切體系(20μl)見表1。

5、EYFP基因轉(zhuǎn)入HW-05重組子篩選

通過同源重組，通過Km^R篩選后進(jìn)行PCR檢測(cè)陽性克隆，在20μLPCR反應(yīng)體系中，以1μL質(zhì)粒DNA(經(jīng)20倍稀釋)為模板，加入相應(yīng)的PCR反應(yīng)成分，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)是否擴(kuò)出特異性條帶，以確定重組子。

PCR體系(20μl)見表3：

表3

擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)見下表4：

表4

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、HW-05總DNA提取

總DNA提取結(jié)果，根據(jù)總DNA提取方法獲得基因組DNA，結(jié)果見圖1。

2、酶切純化后獲得EYFP產(chǎn)物；

選用HindⅢ和BamHⅠ酶切質(zhì)粒EYFP-pBBR1MCS-2，出現(xiàn)兩個(gè)條帶分別約為700bp和2.7kb，結(jié)果見圖2。

3、EYFP基因連接于pBBR1MCS-2載體及鑒定

選擇EYFP基因和pBBR1MCS-2載體共有的HindⅢ和BamHⅠ兩種內(nèi)切酶，進(jìn)行酶切連接后轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，在約為6kb出現(xiàn)條帶，結(jié)果見圖3。

選用HindⅢ和BamHⅠ酶切進(jìn)行驗(yàn)證，出現(xiàn)兩個(gè)條帶分別約為700bp和5kb，結(jié)果見圖4。

4、EYFP轉(zhuǎn)入pBBR1MCS-2重組子篩選

將EYFP基因經(jīng)三親本雜交轉(zhuǎn)入HW-05后，PCR擴(kuò)增EYFP基因，條帶約為700bp的為重組子，結(jié)果見圖5。

5、EYFP基因在HW-05中表達(dá)

顯微鏡下觀察，看到EYFP熒光出現(xiàn)，結(jié)果見圖6。