本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及CRISPR/Cas9特異性敲除人基因組PD-1基因的方法以及用于特異性靶向人PD-1基因的gRNA。

背景技術(shù)：

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是從細(xì)菌和古生菌對(duì)抗外來(lái)病毒或質(zhì)粒的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來(lái)，具體包括三種不同的類(lèi)型，其中 TypeⅡ型的CRISPR/Cas 系統(tǒng)的 DNA 內(nèi)切酶 Cas9 只有一個(gè)亞基，結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單，所以應(yīng)用也最廣泛。除了 Cas9 蛋白外，該系統(tǒng)還包括兩條短的 CRISPR RNAs（crRNAs）和 trans-activating crRNAs（tracrRNA）。成熟的 crRNA-tracrRNA 復(fù)合體可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)指導(dǎo) Cas9 蛋白到靶序列上，并在 PAM（protospacer adjacent motif）附近特異性剪切 DNA 雙鏈，形成 DSB（double strand break）。DSB 可以通過(guò)兩種途徑被修復(fù)，一種是非同源重組的末端接合（Non-Homologous End Joining NHEJ）DNA修復(fù)方式，另一種是同源重組修復(fù)（ Homology Directed Repair HDR) 方式。NHEJ 修復(fù)方式可能產(chǎn)生堿基的插入或缺失，從而產(chǎn)生移碼突變，或者也可能突變成終止密碼子，這些突變形式都可以改變目的基因的開(kāi)放閱讀框； HDR 方式需要一段與被剪切片段同源的模板片段來(lái)修復(fù)DSB，這種修復(fù)方式可以將被用來(lái)作為模板的同源片段的序列復(fù)制到目的基因中，所以可以利用這種修復(fù)方式將特定的基因片段引入到目的基因中。

CRISPR基因編輯的第一個(gè)人體試驗(yàn)由賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的醫(yī)生提出，這個(gè)試驗(yàn)是從癌癥患者體內(nèi)提取出免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞。接著，研究人員將利用CRISPR對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，并將基因修飾后的T細(xì)胞灌注回病人體內(nèi)，這樣它們將靶向摧毀腫瘤細(xì)胞。這種利用CRISPR技術(shù)敲除人體T細(xì)胞的PD-1基因的免疫療法，將用于對(duì)骨髓瘤，黑色素瘤和肉瘤的試驗(yàn)。研究申請(qǐng)獲批利用CRISPR技術(shù)剔除T細(xì)胞中的兩個(gè)基因：一個(gè)基因是PD-1，它是人體免疫反應(yīng)的一種關(guān)鍵性的關(guān)閉開(kāi)關(guān)，抑制T細(xì)胞攻擊腫瘤的能力，因此，若沒(méi)有這個(gè)基因，T細(xì)胞可能就能夠讓逃避免疫系統(tǒng)檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞現(xiàn)形，無(wú)處遁逃；另一個(gè)基因是一種T細(xì)胞受體編碼基因，它能夠調(diào)動(dòng)人體的天然防御進(jìn)行自我保護(hù)。Wolinetz說(shuō)：“基因轉(zhuǎn)移領(lǐng)域的科學(xué)家們對(duì)利用CRISPR/Cas9要比早期的基因編輯系統(tǒng)在更少的時(shí)間內(nèi)以更少的成本修復(fù)或剔除參與多種人類(lèi)疾病中的突變的潛力感到興奮?！?因此，本發(fā)明開(kāi)發(fā)出一種高效、靶向阻斷人PD-1基因的gRNA，對(duì)于CRISPR/cas9系統(tǒng)充分發(fā)揮作用和腫瘤的細(xì)胞治療研究具有極其重要的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于通過(guò)設(shè)計(jì)、構(gòu)建、篩選，最終提供一些基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，同時(shí)靶向人PD-1基因的高效gRNA及其靶位點(diǎn)序列，并用其抑制人PD-1基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增值。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理及其gRNA的設(shè)計(jì)原理為基礎(chǔ)，軟件設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)出一系列的gRNA，并以px458為表達(dá)載體，構(gòu)建了gRNA/cas9表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)篩選和系列分析測(cè)試，最終篩選出18個(gè)有效的gRNA，利用gRNA/cas9表達(dá)系統(tǒng)可敲除人T淋巴細(xì)胞PD-1基因，敲除PD-1基因的人T淋巴細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞治療領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：1.靶向人PD-1基因的高效gRNA及其靶點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)及gRNA/Cas9表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建；2. 在人T淋巴細(xì)胞模型中分析檢測(cè)gRNA內(nèi)源活性，篩選到18 條有效的gRNA，能夠成功靶向敲除PD-1基因，其對(duì)應(yīng)的DNA 序列如序列表SEQ ID NO. 1-18 任意一條序列所示。

說(shuō)明書(shū)附圖

附圖1：靶序列測(cè)序原始結(jié)果，由左到右，由上到下依次為px458-PD-1-gRNA1，px458-PD-1-gRNA2至 px458-PD-1-gRNA25；附圖 2：T7 Endonuclease I 酶切鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J. 薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1 靶向人PD-1基因的gRNA合成及載體構(gòu)建

1.靶向人PD-1基因的gRNA 的選擇和設(shè)計(jì)：:在Genebank中找到人PD-1基因的序列，在人PD-1基因的第1、2外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)潛在靶位點(diǎn)。通過(guò)在線設(shè)計(jì)工具（http://crispr.mit.edu/）及gRNA的設(shè)計(jì)原則，評(píng)估人PD-1基因序列上得分較高的靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)gRNA。靶序列如下：

2.靶向人PD-1基因的gRNA 寡核苷酸序列的合成和真核表達(dá)載體的構(gòu)建：將pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）質(zhì)粒（Addgene plasmid ID：48138，以下簡(jiǎn)稱(chēng)pSpCas9（BB）），用BbSI酶切，37 ℃水浴1小時(shí)后， 1% 的瓊脂糖電泳，回收酶切產(chǎn)物（TAKARA膠回收試劑盒）。 酶切體系如下：

將兩寡核苷酸退火，形成帶有粘性末端的短雙鏈DNA，反應(yīng)體系如下：

將上述反應(yīng)體系在200ul PCR管中混合均勻，然后將PCR管在37℃水浴鍋中處理30min，再放入500ml沸水中，自然冷卻至室溫,連接體系如下：

將帶有粘性末端的雙鏈短DNA產(chǎn)物連入酶切后的pSpCas9(BB)線性片段，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（Takara Code : D9057A），并涂布于Ampicillin濃度為100 μg/mL的LB固體平板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取生長(zhǎng)良好的單克隆，于15 mL Ampicillin濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，命名為px458-PD-1-gRNA1。無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA 的制備：A、取px458-PD-1-gRNA1質(zhì)粒1μL加入100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中吹勻，冰中靜置20min，再放入42℃水浴90s，迅速置于冰浴中3min，加入500μL LB液體培養(yǎng)基，放置搖床180rpm 37℃ 1h，取菌液100μL均勻涂布于Ampicillin濃度為100 μg/mL 的LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜。 B、取單菌落于3mL Ampicillin濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，250rpm、37℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)；從中取300μL菌液接種于300mL Ampicillin濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，并于250rpm、37℃振蕩培養(yǎng)12~16小時(shí)；C、收集菌液，然后在4℃、4000rpm條件下離心15min，棄上清，收集菌體，然后按照QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟提取質(zhì)粒，得無(wú)內(nèi)毒素的px458-PD-1-gRNA1質(zhì)粒。同樣的方法，根據(jù)設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)序列構(gòu)建出另外24個(gè)敲除載體，并提取獲得無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA依次命名為（px458-PD-1-gRNA2、px458-PD-1-gRNA3...... px458-PD-1-gRNA25），將載體測(cè)序，進(jìn)一步確認(rèn)正確，如附圖1所示。

實(shí)施例2 轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞

1、人T淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將T細(xì)胞分離尼龍毛柱（Polysciences，美國(guó)）固定在支架上，倒入37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液，關(guān)閉閥門(mén)一定時(shí)間，然后打開(kāi)閥門(mén)，放掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以清洗幾次尼龍毛，關(guān)上閥門(mén)。將要分離的細(xì)人體血液（血液樣本，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院提供）預(yù)先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，約5.00×10⁷個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞液倒入注射器內(nèi)，使之沒(méi)過(guò)尼龍毛柱。蓋上注射器，37℃溫育45min至1h。打開(kāi)下口，緩慢放流（1滴/min），收集于離心管中。離心，即獲所需的T淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基（RPMI-1640+10%胎牛血清+1%雙抗，Gbico）培養(yǎng)至600-800萬(wàn)/T75即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2、人T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將px458-PD-1-gRNA1轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞。轉(zhuǎn)染體系及試劑使用Lipofectamine? 2000（invitrogen公司），轉(zhuǎn)染詳細(xì)步驟參照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，吸掉廢液加入1ml PBS重懸細(xì)胞，取500ul放入原瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，剩余細(xì)胞放入1.5ml離心管，提取DNA（按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。以提取的DNA為模板，擴(kuò)增靶點(diǎn)序列。PCR反應(yīng)體系如下：

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30 s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min，最后4℃保溫。通過(guò)驗(yàn)證靶點(diǎn)序列突變情況來(lái)確定px458-PD-1-gRNA1質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的活性。PCR產(chǎn)物用T7 Endonuclease I 50℃水浴酶切1h，酶切體系如下：

結(jié)果如附圖2顯示：靶點(diǎn)序列若沒(méi)有發(fā)生突變，則說(shuō)明px458-PD-1-gRNA1敲除載體在目標(biāo)靶點(diǎn)沒(méi)有活性，說(shuō)明該靶點(diǎn)序列不能作為PD-1基因敲除的靶位點(diǎn)。同樣方法，檢測(cè)剩余24個(gè)靶點(diǎn)，酶切檢測(cè)結(jié)果顯示，靶點(diǎn)2、3、4、5、6、7、8、10、11、15、16、17、18、19、20、22、23、24發(fā)生突變，說(shuō)明該敲除載體在靶點(diǎn)具有較高的活性；靶點(diǎn)1、9、12、13、14、21、25均不能使靶位點(diǎn)發(fā)生突變。

實(shí)施例3 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)突變

按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用TAKARA試劑盒進(jìn)行純化后連接至 PMD18-T載體上，連接體系如下：

在16℃下連接2小時(shí)。取感受態(tài)細(xì)胞DH5α，放置冰中融化5min，加入10ul連接產(chǎn)物吹勻，放置冰中20min。42℃熱擊90s，迅速轉(zhuǎn)入冰浴中靜置3min，加入500ul的LB液體培養(yǎng)基，置于搖床中，37℃ 180rpm 1h。取菌液100ul均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基（含1/1000AMP），37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落，分別放入3ml LB液體培養(yǎng)基（含3ul AMP），37℃ 200rpm 12h。以1ul菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定，均為陽(yáng)性。將菌液送樣到上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，靶點(diǎn)2、3、4、5、6、7、8、10、11、15、16、17、18、19、20、22、23、24敲除的細(xì)胞中，均能檢測(cè)到人PD-1基因發(fā)生突變，進(jìn)一步驗(yàn)證以上靶位點(diǎn)具有活性，可以根據(jù)靶點(diǎn)序列構(gòu)建CRISPR/Cas9載體敲除人PD-1基因。

測(cè)序結(jié)果：靶點(diǎn)2細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾龋l(fā)生了基因突變，缺失3個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.1；靶點(diǎn)3細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失2個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.2；靶點(diǎn)4細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失11個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.3；靶點(diǎn)5細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，增加4個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.4；靶點(diǎn)6細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失6個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.5；靶點(diǎn)7細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失8個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.6；靶點(diǎn)8細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失19個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.7；靶點(diǎn)10細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失2個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.8；靶點(diǎn)11細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，增加2個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.9；靶點(diǎn)15細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失1個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.10；靶點(diǎn)16細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失14個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.11；靶點(diǎn)17細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾龋l(fā)生了基因突變，缺失4個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.12；靶點(diǎn)18細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失7個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.13；靶點(diǎn)19細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失6個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.14；靶點(diǎn)20細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失2個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.15；靶點(diǎn)22細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失34個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.16；靶點(diǎn)23細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失24個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.17；靶點(diǎn)24細(xì)胞克隆基因與野生型的PD-1基因?qū)φ障啾?，發(fā)生了基因突變，缺失11個(gè)堿基，其對(duì)應(yīng)的序列表見(jiàn)SEQ ID NO.18。

PD-1(Wild type control group)

actccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacag

SEQ ID NO.1

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SEQ ID NO.2

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SEQ ID NO.3

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SEQ ID NO.4

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SEQ ID NO.5

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SEQ ID NO.7

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SEQ ID NO.8

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SEQ ID NO.9

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SEQ ID NO.10

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SEQ ID NO.11

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SEQ ID NO.12

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SEQ ID NO.13

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SEQ ID NO.14

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SEQ ID NO.15

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SEQ ID NO.16

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SEQ ID NO.17

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SEQ ID NO.18

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