用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌及在液體發(fā)酵中的應(yīng)用
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌及在液體發(fā)酵中的應(yīng)用。
[0002]技術(shù)背景:
棉籽蛋白是從棉籽中提取的一種植物蛋白，主要有棉籽柏、棉籽餅等形式，經(jīng)壓榨處理的棉籽稱為棉籽餅，溶劑浸提的稱為棉籽柏。棉籽(餅)柏不但富含維生素BI，磷、鈣等元素，還具有豐富的植物性蛋白質(zhì)，水解后可得到17種氨基酸，是畜牧業(yè)生產(chǎn)中物美價廉的蛋白質(zhì)來源。但是由于它含有棉酚等抗營養(yǎng)因子，限制了棉籽(餅)柏的利用，因此研究棉籽脫酚是當前的熱點。
[0003]目前常用的脫酚方法為采用有機溶劑對棉籽蛋白進行萃取，如申請?zhí)枮?00910263903.8的中國專利，采用六號溶劑分階段噴淋萃取，得到脫酚棉籽柏；申請?zhí)枮?01310152646.7的中國專利，采用60%_68%的含水甲醇或含水乙醇作為溶劑，得到脫酚棉籽柏。上述方法不但消耗大量有機溶劑，而且會造成環(huán)境污染。
[0004]此外，還可以通過微生物為載體進行發(fā)酵的方法將棉柏中的棉酚轉(zhuǎn)化為其他無毒物質(zhì)，達到脫毒的目的。例如專利申請?zhí)?200810097352.8的中國專利，從動物腸道中篩選一株乳酸桿菌CGMCC N0.2426，接種在棉籽柏中進行固體發(fā)酵，結(jié)果顯示脫毒率達到48%-56%，可以使游離棉酹的含量達到220ppm-260ppm。該方法屬于微生物固態(tài)菌種發(fā)酵脫毒法，具有脫毒率較高，投資小，成本低，工藝簡單，發(fā)酵過程增加如生物活性多肽等物質(zhì)，改善營養(yǎng)條件等優(yōu)點。但是，這種固態(tài)發(fā)酵方法轉(zhuǎn)化后棉酚含量任然較高，不能安全應(yīng)用在飼料等方面。因此尋找新的菌株進行發(fā)酵脫棉酚成為一種新的研究趨勢。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，從儲存棉籽倉庫的土壤中篩選出一株具有高效堿性蛋白酶活性并能夠有效分解棉酚的枯草芽孢桿菌，發(fā)酵條件優(yōu)化后，應(yīng)用到液體發(fā)酵，結(jié)果可將棉籽中游離棉酚含量降到極低，滿足飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)對棉籽蛋白的需求，該菌株同時具備較強的堿性蛋白酶和脫酚能力，既能用于分解棉籽蛋白中的大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子及棉酚等抗營養(yǎng)因子，又可以作為腸道益生菌附著在動物體內(nèi)長期存活。為此，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
一種用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌，該枯草芽孢桿菌Subtilis)的保藏名稱為ESIGMA-945，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2014412，保藏日期:2014年9月14號。
[0006]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Subtilis) ESIGMA-945菌株，包括如下生物學(xué)特性:(I)菌株呈長桿狀；(2)菌落呈乳白色，表面粗糙不透明，邊緣光滑；(3)發(fā)酵后可產(chǎn)生堿性蛋白酶；(4)產(chǎn)堿性蛋白酶穩(wěn)定性條件為溫度20°C -55°C, pH 8.5-11.5 ; (5)溫度35°C,pH 8.5，接種量2%，發(fā)酵時間28h的條件下，可發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶800U/ml。該篩選菌株具有較強的產(chǎn)堿性蛋白酶活性。
[0007]本發(fā)明還涉及枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟:
(I)菌株粗篩: 取棉籽儲存?zhèn)}庫周圍的土壤樣品加入到無菌去離子水中稀釋，移取Iml稀釋液到富集培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)160r/min條件下恒溫搖床富集培養(yǎng)44_52h ;超凈工作臺上取出富集培養(yǎng)后的菌液，進行梯度稀釋，稀釋后分別涂布于分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)44-52h;挑取能夠在分離培養(yǎng)基上正常生長的單菌落，純化3次，得純種微生物菌株；篩選的菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏；
其中，富集培養(yǎng)基配方為:蛋白胨7-9 g，酵母膏2-4 g，牛肉膏3-5 g，氯化鈉4-6 g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ;分離培養(yǎng)基配方為:干酪素7-9g，瓊脂12-18 g ,氯化鈉4-6g,加去離子水定容至1000ml,利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ；
(2)菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩:
初篩的純種微生物菌株接種于產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)200r/min條件下恒溫搖床發(fā)酵培養(yǎng)44-52h ;發(fā)酵培養(yǎng)液在溫度4 °C、轉(zhuǎn)數(shù)12000r/min條件下離心8min，分離得上清液即為粗酶液，粗酶液采用Folin酚顯色法測定其堿性蛋白酶活性，進行菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩；篩選強堿性蛋白酶活性菌株為目標菌株，用于下一步研究；將篩到的菌株放入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏；
其中產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨7-9 g，牛肉膏3-5 g，氯化鈉4-6 g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-11.5 ；
(3)菌種脫酚能力復(fù)篩
將堿性蛋白酶復(fù)篩得到的菌株接種于以棉酚為碳源的發(fā)酵液中，溫度37°C，轉(zhuǎn)數(shù)200r / min恒溫搖床發(fā)酵培養(yǎng)54 h ;發(fā)酵后培養(yǎng)液在溫度4°C,轉(zhuǎn)數(shù)10000 r/min條件下離心獲得上清液，上清液經(jīng)0.2 μ m微孔濾膜過濾除菌，除菌后干燥得樣品；以間苯三酚法分別測定發(fā)酵前后發(fā)酵液中棉酚的含量，計算發(fā)酵液中棉酚的降解量，篩選降解量高的菌株為目標菌株；目標菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏；
其中，棉酚為碳源的發(fā)酵液配方為:棉酚6-8 g，硫酸銨1-2 g，七水硫酸鎂0.2-0.4 g，磷酸二氫鈉0.7-0.9 g，氯化鈣0.1-0.3 g，磷酸氫二鉀0.3-0.5 g，瓊脂13-18 g，加去離子水 1000 mL, pH 8.5-9.5。
[0008]經(jīng)過上述步驟的篩選，即可得到既能對棉籽蛋白進行發(fā)酵以降低棉酚含量，又能產(chǎn)生高含量的堿性蛋白酶對動物腸道有益的枯草芽孢桿菌，其中，枯草芽孢桿菌ESIGMA-945棉酚降解率高達94.64%，能有效降解棉籽餅(柏沖的游離棉酹，達到使棉籽餅(柏)脫毒的效果。
[0009]本發(fā)明還涉及枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，包括以下工藝流程:
(1)枯草芽孢桿菌活化后以1-5%接種量接種到液體培養(yǎng)基中，在35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22-26h，獲得的發(fā)酵液；
(2)步驟(I)中發(fā)酵液接種到新培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)入35°C種子培養(yǎng)罐培養(yǎng)46-50h，培養(yǎng)結(jié)束后獲得液體菌種；
(3)棉籽蛋白加水混勻后進行蒸汽滅菌，滅菌結(jié)束后冷卻備用；
(4)滅菌冷卻的棉籽蛋白加入步驟(3)中液體菌種，充分攪拌，進行液體發(fā)酵。
[0010]進一步的，所述棉籽蛋白和液體菌種質(zhì)量比為1: 3-6。
[0011]進一步的，所述棉籽蛋白和液體菌種質(zhì)量比優(yōu)選1:5。
[0012]進一步的，所述液體發(fā)酵中發(fā)酵溫度為32_40°C，pH為8.5-11.5，接種量為1_5%，發(fā)酵時間為24-72h，轉(zhuǎn)速為180-220r/min。
[0013]進一步的所述液體發(fā)酵的優(yōu)選條件為發(fā)酵溫度40°C，pH 10，發(fā)酵時間24h，轉(zhuǎn)速220r/min
接種量5%。正交實驗及綜合分析結(jié)果顯示，該條件下，脫毒效果最好，棉酚的含量可以降低98%( < 1ppm)，達到國家飼料用棉籽餅柏的安全標準為棉酚含量在200ppm以下。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明篩選出一株既能對棉籽蛋白進行發(fā)酵以降低棉酚含量，又能產(chǎn)生高含量的堿性蛋白酶對動物腸道有益的枯草芽孢桿菌；該菌株應(yīng)用到液體發(fā)酵中，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，可將游離棉酚含量降到極低，滿足飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)對棉籽蛋白的需求；該發(fā)明工藝簡單、安全環(huán)保、成本低廉、易于推廣，所得發(fā)酵后棉籽蛋白產(chǎn)品含有枯草芽孢桿菌等有益菌還具有能夠增強動物機體免疫力等功效。
[0015]【具體實施方式】:
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0016]下述實施例中所用的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、氯化鈉、干酪素、瓊脂、(NH4)2S04、MgSO4.7H20、NaH2