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[0017]實(shí)施例1
一種用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌QBacillus Subtilis) ESIGMA-945,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2014412。
[0018]所述枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特性包括:
(1)菌株呈長(zhǎng)桿狀；
(2)菌落呈乳白色，表面粗糙不透明，邊緣光滑；
(3)發(fā)酵后可產(chǎn)生堿性蛋白酶；
(4)該枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶穩(wěn)定性條件為溫度20°C-55°C, pH值8.5-11.5 ；
(5)該枯草芽孢桿菌在溫度35°C，pH8.5，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間28h的條件下，可發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶800U/ml。
[0019]所述枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟:
(1)菌株粗篩:
取棉籽儲(chǔ)存?zhèn)}庫(kù)周圍的土壤樣品加入到無(wú)菌去離子水中稀釋，移取Iml稀釋液到富集培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)160r/min條件下恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)48h ;超凈工作臺(tái)上取出富集培養(yǎng)后的菌液，進(jìn)行梯度稀釋，稀釋后分別涂布于分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h ;挑取能夠在分離培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的單菌落，純化3次，得純種微生物菌株；篩選的菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保臧；
其中，富集培養(yǎng)基配方為:蛋白胨8 g，酵母膏3 g，牛肉膏4 g，氯化鈉5 g，加水至1000ml，利用氨水將pH調(diào)至8.5-9.5 ;分離培養(yǎng)基配方為:干酪素8 g，瓊脂15 g ,氯化鈉5g,加去離子水定容至1000ml,利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ；
(2)菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩:
初篩的純種微生物菌株接種于產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)200r/min條件下恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)48h ;發(fā)酵培養(yǎng)液在溫度4 °C、轉(zhuǎn)數(shù)12000r/min條件下離心8min，分離得上清液即為粗酶液，粗酶液采用Folin酚顯色法測(cè)定其堿性蛋白酶活性，進(jìn)行菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩；篩選強(qiáng)堿性蛋白酶活性菌株為目標(biāo)菌株，用于下一步研究；將篩到的菌株放入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏；
其中產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨8 g，牛肉膏4 g，氯化鈉5 g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-11.5;
(3)菌種脫酚能力復(fù)篩
將堿性蛋白酶復(fù)篩得到的菌株接種于以棉酚為碳源的發(fā)酵液中，溫度37°C，轉(zhuǎn)數(shù)200r / min恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)54 h ;發(fā)酵后培養(yǎng)液在溫度4°C,轉(zhuǎn)數(shù)10000 r/min條件下離心獲得上清液，上清液經(jīng)0.2 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，除菌后干燥得樣品；以間苯三酚法分別測(cè)定發(fā)酵前后發(fā)酵液中棉酚的含量，脫毒后的棉籽蛋白中棉酚含量< 20ppm，計(jì)算發(fā)酵液中棉酚的降解量，篩選降解量高的菌株為目標(biāo)菌株；目標(biāo)菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏；
其中，棉酚為碳源的發(fā)酵液配方為:棉酚7 g，硫酸銨1.5 g，七水硫酸鎂0.3 g，磷酸二氫鈉0.8 g，氯化鈣0.2 g，磷酸氫二鉀0.4 g，瓊脂15 g，加去離子水定容至1000 mL，調(diào)整pH 為 8.5-9.5。
[0020]所述枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，包括以下工藝流程:
枯草芽孢桿菌活化后以2%接種量接種，在35°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，獲得的發(fā)酵液接種到新培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入35°C種子培養(yǎng)罐培養(yǎng)48h，獲得液體菌種；棉籽蛋白加水后進(jìn)行蒸汽滅菌，冷卻后加入上述液體菌種,棉籽蛋白和液體菌種質(zhì)量比即液體發(fā)酵中固液質(zhì)量比為1:5，充分?jǐn)嚢瑁趐H 9.0，溫度35°C，轉(zhuǎn)數(shù)200r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h。
[0021]發(fā)酵前后培養(yǎng)液分別以苯胺法法測(cè)定其中棉酚含量，計(jì)算發(fā)酵液中棉酚的降解率，結(jié)果顯示該條件下棉酚的降解率為95.31%。
[0022]實(shí)施例2
枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟:
(1)菌株粗篩:
取棉籽儲(chǔ)存?zhèn)}庫(kù)周圍的土壤樣品加入到無(wú)菌去離子水中稀釋，移取Iml稀釋液到富集培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)160r/min條件下恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)44h ;超凈工作臺(tái)上取出富集培養(yǎng)后的菌液，進(jìn)行梯度稀釋，稀釋后分別涂布于分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)44h ;挑取能夠在分離培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的單菌落，純化3次，得純種微生物菌株；篩選的菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保臧；
其中，富集培養(yǎng)基配方為:蛋白胨7 g，酵母膏2 g，牛肉膏3 g，氯化鈉4g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ;分離培養(yǎng)基配方為:干酪素7 g，瓊脂12 g，氯化鈉4g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ；
(2)菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩:
初篩的純種微生物菌株接種于產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)200r/min條件下恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)44h ;發(fā)酵培養(yǎng)液在溫度4 °C、轉(zhuǎn)數(shù)12000r/min條件下離心8min，分離得上清液即為粗酶液，粗酶液采用Folin酚顯色法測(cè)定其堿性蛋白酶活性，進(jìn)行菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩；篩選強(qiáng)堿性蛋白酶活性菌株為目標(biāo)菌株，用于下一步研究；將篩到的菌株放入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏； 其中產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨7 g，牛肉膏3 g，氯化鈉4 g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-11.5;
(3)菌種脫酚能力復(fù)篩
將堿性蛋白酶復(fù)篩得到的菌株接種于以棉酚為碳源的發(fā)酵液中，溫度37°C，轉(zhuǎn)數(shù)200r / min恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)54 h ;發(fā)酵后培養(yǎng)液在溫度4°C,轉(zhuǎn)數(shù)10000 r/min條件下離心獲得上清液，上清液經(jīng)0.2 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，除菌后干燥得樣品；以間苯三酚法分別測(cè)定發(fā)酵前后發(fā)酵液中棉酚的含量，計(jì)算發(fā)酵液中棉酚的降解量，篩選降解量高的菌株為目標(biāo)菌株；目標(biāo)菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏；
其中，棉酚為碳源的發(fā)酵液配方為:棉酚6 g，硫酸銨I g，七水硫酸鎂0.2 g，磷酸二氫鈉0.7 g，氯化鈣0.1 g，磷酸氫二鉀0.35 g，瓊脂13 g，加去離子水定容至1000 mL，調(diào)整pH為8.5-9.5?？莶菅挎邨U菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，包括以下工藝流程:
枯草芽孢桿菌活化后以1%接種量接種，在35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h，獲得的發(fā)酵液接種到新培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)入35°C種子培養(yǎng)罐培養(yǎng)46h，獲得液體菌種；棉籽蛋白加水后進(jìn)行蒸汽滅菌，結(jié)束后冷卻并加入上述液體菌種，棉籽蛋白和液體菌種質(zhì)量比為1:3，充分?jǐn)嚢?，在發(fā)酵溫度32°C，pH 8.5，轉(zhuǎn)速180r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h。
[0023]發(fā)酵前后培養(yǎng)液分別以苯胺法測(cè)定其中棉酚含量，計(jì)算發(fā)酵液中棉酚的降解率，結(jié)果顯示該條件下棉酚的降解為89.65%。
[0024]實(shí)施例3
枯草芽孢桿菌篩選方法，包括以下步驟:
(1)菌株粗篩:
取棉籽儲(chǔ)存?zhèn)}庫(kù)周圍的土壤樣品加入到無(wú)菌去離子水中稀釋，移取Iml稀釋液到富集培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)160r/min條件下恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)52h ;超凈工作臺(tái)上取出富集培養(yǎng)后的菌液，進(jìn)行梯度稀釋，稀釋后分別涂布于分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)52h;挑取能夠在分離培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的單菌落，純化3次，得純種微生物菌株；篩選的菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保臧；
取其中，富集培養(yǎng)基配方為:蛋白胨9 g，酵母膏4 g，牛肉膏5 g，氯化鈉6 g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ;分離培養(yǎng)基配方為:干酪素9 g，瓊脂18g，氯化鈉6g,加去離子水定容至1000ml,利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ；
(2)菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩:
初篩的純種微生物菌株接種于產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基