中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)200r/min條件下恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)52h ;發(fā)酵培養(yǎng)液在溫度4 °C、轉(zhuǎn)數(shù)12000r/min條件下離心8min，分離得上清液即為粗酶液，粗酶液采用Folin酚顯色法測定其堿性蛋白酶活性，進行菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩；篩選強堿性蛋白酶活性菌株為目標(biāo)菌株，用于下一步研究；將篩到的菌株放入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏；
其中產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨9 g，牛肉膏5 g，氯化鈉6 g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-11.5;
(3)菌種脫酚能力復(fù)篩
將堿性蛋白酶復(fù)篩得到的菌株接種于以棉酚為碳源的發(fā)酵液中，溫度37°C，轉(zhuǎn)數(shù)200r / min恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)54 h ;發(fā)酵后培養(yǎng)液在溫度4°C,轉(zhuǎn)數(shù)10000 r/min條件下離心獲得上清液，上清液經(jīng)0.2 μ m微孔濾膜過濾除菌，除菌后干燥得樣品；以間苯三酚法分別測定發(fā)酵前后發(fā)酵液中棉酚的含量，計算發(fā)酵液中棉酚的降解量，篩選降解量高的菌株為目標(biāo)菌株；目標(biāo)菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏；
其中，棉酚為碳源的發(fā)酵液配方為:棉酚8 g，硫酸銨2 g，七水硫酸鎂0.4 g，磷酸二氫鈉0.9 g,氯化I丐0.3 g,磷酸氫二鉀0.5 g，瓊脂18 g,加去離子水定容至1000 mL,調(diào)整pH為 8.5-9.5。
[0025]枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，包括以下工藝流程:
枯草芽孢桿菌活化后以5%接種量接種，在35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)26h，獲得的發(fā)酵液接種到新培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)入到35°C種子培養(yǎng)罐培養(yǎng)50h，獲得液體菌種；棉籽蛋白加水后進行蒸汽滅菌，冷卻后加入上述液體菌種，調(diào)整棉籽蛋白和液體菌種比即液體發(fā)酵中固液質(zhì)量比為1:6，充分?jǐn)嚢瑁跍囟?0°C，pH 11.5，轉(zhuǎn)速2201'/11^11條件下，發(fā)酵培養(yǎng)7211。
[0026]發(fā)酵前后培養(yǎng)液分別以苯胺法測定其中棉酚含量，計算發(fā)酵液中棉酚的降解率，結(jié)果顯示該條件下棉酚的降解率為97.56%。
[0027]以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌，其特征在于，該枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)的保藏名稱為ESIGMA-945，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M 2014412，保藏日期:2014年9月14號。
2.—種權(quán)利要求1所述的用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)菌株初篩: 取棉籽儲存?zhèn)}庫周圍的土壤樣品加入到無菌去離子水中稀釋，移取Iml稀釋液到富集培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)160r/min條件下恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)44_52h ;超凈工作臺上取出富集培養(yǎng)后的菌液，進行梯度稀釋，稀釋后分別涂布于分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)44-52h;挑取能夠在分離培養(yǎng)基上正常生長的單菌落，純化3次，得純種微生物菌株；篩選的菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏； 其中，富集培養(yǎng)基配方為:蛋白胨7-9 g，酵母膏2-4 g，牛肉膏3-5 g，氯化鈉4-6 g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ;分離培養(yǎng)基配方為:干酪素7-9g，瓊脂12-18 g ,氯化鈉4-6g,加去離子水定容至1000ml,利用氨水調(diào)整pH為8.5-9.5 ； (2)菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩: 初篩的純種微生物菌株接種于產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度37°C、轉(zhuǎn)數(shù)200r/min條件下恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)44-52h ;發(fā)酵培養(yǎng)液在溫度4 °C、轉(zhuǎn)數(shù)12000r/min條件下離心8min，分離得上清液即為粗酶液，粗酶液采用Folin酚顯色法測定其堿性蛋白酶活性，進行菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩；篩選強堿性蛋白酶活性菌株為目標(biāo)菌株，用于下一步研究；將篩到的菌株放入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏； 其中產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨7-9 g，牛肉膏3-5 g，氯化鈉4-6 g，加去離子水定容至1000ml，利用氨水調(diào)整pH為8.5-11.5 ； (3)菌種脫酚能力復(fù)篩 將堿性蛋白酶復(fù)篩得到的菌株接種于以棉酚為碳源的發(fā)酵液中，溫度37°C，轉(zhuǎn)數(shù)200r / min恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)54 h ;發(fā)酵后培養(yǎng)液在溫度4°C,轉(zhuǎn)數(shù)10000 r/min條件下離心獲得上清液，上清液經(jīng)0.2 μ m微孔濾膜過濾除菌，除菌后干燥得樣品；以苯胺法后發(fā)酵液中棉酚的含量，計算發(fā)酵液中棉酚的降解量，篩選降解量高的菌株為目標(biāo)菌株；目標(biāo)菌株接入LB固體培養(yǎng)基中斜面保藏； 其中，棉酚為碳源的發(fā)酵液配方為:棉酚6-8 g，硫酸銨1-2 g，七水硫酸鎂0.2-0.4 g，磷酸二氫鈉0.7-0.9 g，氯化鈣0.1-0.3 g，磷酸氫二鉀0.3-0.5 g，瓊脂13-18 g，加去離子水定容至1000 mL，調(diào)整pH為8.5-9.5。
3.—種權(quán)利要求1所述的用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下工藝流程: (1)枯草芽孢桿菌活化后以1-5%接種量接種到液體培養(yǎng)基中，在35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22-26h，獲得發(fā)酵液； (2)步驟(I)中發(fā)酵液接種到新培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)入35°C種子培養(yǎng)罐培養(yǎng)46-50h，培養(yǎng)結(jié)束后獲得液體菌種； (3)棉籽蛋白加水混勻后進行蒸汽滅菌，滅菌結(jié)束后冷卻備用； (4)滅菌冷卻的棉籽蛋白加入步驟(3)中液體菌種，充分?jǐn)嚢?，進行液體發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于，所述棉籽蛋白和液體菌種質(zhì)量比為1: 3-6。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于，所述棉籽蛋白和液體菌種質(zhì)量比優(yōu)選1:5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任意一項所述的用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于，所述液體發(fā)酵發(fā)酵溫度為32-40°C，pH為8.5-11.5，接種量為1_5%，發(fā)酵時間為24-72h，轉(zhuǎn)速為180-220r/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-5任意一項所述的用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于，所述液體發(fā)酵優(yōu)選條件為發(fā)酵溫度40°C，pH 10，接種量5%，發(fā)酵時間 24h，轉(zhuǎn)速 220r/min。
【專利摘要】一種用于棉籽蛋白發(fā)酵的枯草芽孢桿菌（ Bacillus Subtilis ）ESIGMA-945，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2014412，保藏日期：2014年9月14號；該枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）ESIGMA-945的篩選方法主要通過菌株粗篩、菌種產(chǎn)堿性蛋白酶復(fù)篩和菌種脫酚能力復(fù)篩得到；該枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）ESIGMA-945可應(yīng)用到液體發(fā)酵中。本發(fā)明篩選出一株既能對棉籽蛋白進行發(fā)酵以降低棉酚含量，又能產(chǎn)生高含量的堿性蛋白酶對動物腸道有益的枯草芽孢桿菌；該菌株應(yīng)用到液體發(fā)酵中，可將游離棉酚含量降到極低，滿足飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)對棉籽蛋白的需求；該發(fā)明工藝簡單、安全環(huán)保、成本低廉、易于推廣，所得發(fā)酵后棉籽蛋白產(chǎn)品含有枯草芽孢桿菌等有益菌還具有能夠增強動物機體免疫力等功效。CCTCC NO：M 201441220140914
【IPC分類】A23K1-16, C12N1-20, C12R1-125, C12N9-52
【公開號】CN104531569
【申請?zhí)枴緾N201410773649
【發(fā)明人】常藝海, 陳貴才, 王麗, 崔志文, 孫中遠
【申請人】浙江匯能動物藥品有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月16日